染色体捕获关联（ACT）检测是一种用于鉴定远端DNA相互作用的新型无偏倚方法。对远端DNA相互作用的表征将有助于我们确定在正常生理状态以及疾病状态下，细胞核结构与基因表达之间的关系。
本文内容
摘要
摘要
DNA编码的遗传信息以复杂且高度调控的染色质结构进行组织。每条染色体占据特定的空间区域，其位置可能随发育阶段或细胞周期而变化。基因表达可在特化的转录工厂中进行，此时染色质片段可从不同染色体区域环出，导致在不同染色体上或同一染色体上相距较远的DNA片段发生共定位。染色体相关捕获（Associated Chromosome Trap，ACT）检测通过扩展和改进染色体构象捕获技术，提供了一种无偏倚识别这些长距离DNA关联的有效方法。ACT检测使我们能够研究反式转录调控的机制，并有助于阐明在正常生理状态及疾病状态下，细胞核结构与基因表达之间的关系。
方案
1. 长程染色质相互作用的甲醛固定
- 将HL-60人细胞系在含15% FBS和1×青霉素/链霉素的RPMI1640培养基中培养至80–90%融合度，培养箱条件为37°C、5% CO2。
- 将细胞收集至50 ml Nunc离心管中，于1,200 rpm离心15分钟，随后吸除上清液。
- 加入5 ml培养基重悬细胞沉淀，用血细胞计数板计数细胞。取约1×107个细胞，用40 ml RPMI1640/10% FBS重悬，然后加入1.7 ml 37%甲醛以固定稀释的染色质。
- 室温下轻轻振荡孵育10分钟，随后加入2.4 ml 2 M甘氨酸终止反应。在4°C下以1,200 rpm离心15分钟，弃去上清液。用40 ml预冷的PBS洗涤沉淀一次，再次离心后弃去PBS。
2. 裂解细胞以分离细胞核
- 在 40 ml 冰冷的裂解缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0，10 mM NaCl，0.2% NP-40）中重悬细胞，加入新鲜配制的蛋白酶抑制剂（1:500 稀释）和 0.1 mM PMSF。在冷室中旋转孵育 90 分钟，于 2,500 rpm 离心 15 分钟，弃去上清液。
3. 使用 Bgl II 进行限制性酶切
- 将细胞核重悬于 0.5 ml 1 × NEB 缓冲液 3 中，加入 15 μl 10% SDS。37°C 摇床孵育 1 小时，然后加入 45 μl 20% Triton X-100 以结合 SDS。37°C 继续摇床孵育 1 小时。
- 取 1 × 106 个细胞核（约 15 μg，相当于原始细胞的十分之一）用于限制性内切酶消化。从步骤 3.1 中取出 55 μl 细胞核溶液，加入 433 μl 1 × NEB 缓冲液 3 和 12 μl Bgl II（50 U/μl），总体积补至 500 μl。37°C 孵育过夜。
4. 相互作用DNA片段的连接
- 加入 95 μl 10% SDS 以灭活限制性内切酶，并在水浴中于 65 °C 加热 20 分钟进行变性。
- 加入 7 ml 1× 连接缓冲液（30 mM Tris-HCl，pH 8.0，10 mM MgCl2，10 mM DTT，1 mM ATP）和 360 μl 20% Triton X-100，于 37°C 孵育 1 小时。
- 将温度降至 16°C，加入 50 μl 400 U/μl T4 DNA 连接酶。样品在 16 °C 孵育 4 小时，随后在室温下孵育 30 分钟。
5. DNA 纯化
- 加入 300 μg 蛋白酶 K，在 65°C 下孵育过夜。
- 加入 5 μg RNase A，在 37°C 下孵育 30 分钟。
- 用苯酚/氯仿抽提法纯化 DNA，并用异丙醇沉淀 DNA。将 DNA 溶解于 150 μl 无菌蒸馏水中。
6. 使用 Msp I 进行消化并与寡核苷酸连接子连接
- 将2μg纯化的DNA与5单位的Msp I在37°C孵育4-6小时。在65°C灭活Msp I 10分钟，然后加入1 μl浓度为5 mg/ml的糖原，通过乙醇沉淀DNA。将DNA沉淀溶解于50 μl无菌蒸馏水中。
- 将50 μl经Msp I处理的DNA与2 μl浓度为20 μM的接头寡核苷酸L（5'-gctgaccctgaattcgcacgtgcctgtcgttagcggacacagggcgattcac-3'）、1 μl浓度为20 μM的寡核苷酸S（5'-cggtgaatc-3'）、1 μl无菌蒸馏水以及6 μl 10× T4 DNA连接酶缓冲液混合。用液体石蜡覆盖混合物。
- 在PCR仪中于50°C变性寡核苷酸1分钟，随后以每分钟0.5°C的降温速率逐步冷却至10°C。
- 加入1 μl浓度为400 U/μl的T4 DNA连接酶，在15°C孵育过夜。使用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化连接接头后的DNA，并洗脱于50 μl无菌蒸馏水中。
7. PCR 扩增与序列分析
- 选择用于检测长距离相互作用（即“诱饵”）的特定 DNA 区域的引物。在本示例中，我们使用 ABL-1。
- 取 1 μl 纯化的 DNA 进行第一轮 PCR，加入 1 μl 20 μM 的 ABL-1 特异性引物 #4656（5'-gttcaagcgattctcctgcctcga-3'）、1 μl 20 μM 的连接子特异性引物 #2963（5'-gctgaccctgaattcgcacgtgcct-3'）、3 μl 3 x Klen Taq DNA 聚合酶 I 混合液和 3 μl 无菌去离子水。在 PCR 扩增前，将 2 μl 的 32P-dCTP 加入 100 μl 的 3 x Klen Taq DNA 聚合酶 I 混合液中。热循环程序为：72°C 预延伸 2 分钟，95°C 变性 2 分钟；随后进行 18 个循环（95°C 变性 20 秒，65°C 退火 40 秒，72°C 延伸 1 分钟）；最后在 72°C 延伸 5 分钟。
- 使用 QIAquick PCR 纯化试剂盒纯化第一轮 PCR 产物，并用 30 μl 无菌去离子水洗脱 DNA。
- 取 1 μl 第一轮 PCR 产物（稀释 100 倍后）作为模板，加入 1 μl 20 μM 的 ABL-1 特异性巢式引物 #4626（5'-ggagaatttttatctgcctctgtga-3'）（图 1a）、1 μl 20 μM 的连接子特异性引物 #2961（5'-gtcgttagcggacacagggcgattc-3'）、3 μl 3 x Klen Taq DNA 聚合酶 I 混合液和 3 μl 无菌去离子水，进行第二轮 PCR。热循环程序为：25 个循环（95°C 变性 20 秒，67°C 退火 40 秒，72°C 延伸 1 分钟），最后在 72°C 延伸 5 分钟。
- 通过 5% 尿素-PAGE 凝胶电泳检测 PCR 产物，并使用磷屏成像仪扫描凝胶（图 1b）。每条 PCR 条带可通过将凝胶条带切下并置于含有 60 μl 无菌去离子水的离心管中，95°C 孵育 5 分钟溶解回收。短暂离心（10,000 rpm，10 秒）以收集样品。取 1 μl 回收产物作为 DNA 模板，使用引物对 2961/4626 在相同条件下进行 PCR 扩增。PCR 产物经 QIAquick PCR 纯化试剂盒纯化后可进行测序分析。
- 使用在线工具在 http://genome.ucsc.edu 网站分析 DNA 序列的染色体定位（图 1c）。点击“BLAT”进入新窗口，可粘贴 DNA 序列；点击“submit”后出现新页面，显示“BLAT 搜索结果”。点击与目标序列 100% 匹配的比对结果中的“browser”，进入下一窗口以查看该 DNA 序列的染色体位置。
8. 代表性结果
1. 使用 ABL-1 区域作为诱饵的ACT检测，以确定其远距离DNA相互作用
如图1a所示，ACT实验选择了两个Bgl II位点和一个BamH I位点。在第二轮PCR中，使用引物对4626/2961扩增ABL-M1，4630/2961扩增ABL-M2，4636/2961扩增ABL-M3。典型的凝胶电泳图谱显示一条或多条条带（图1b）。ACT实验中每个片段均由两个DNA片段连接而成：其中一个片段来源于诱饵DNA区域，另一个片段来源于与之相连的配对序列，该配对序列通过第一个限制性酶切位点序列与诱饵区域片段连接。第二个酶切位点序列将出现在配对序列的末端（图1c）。克隆得到的ABL-M1片段包含位于9号染色体q32.4区域的ABL1基因DNA序列，位置为+133,592,306-133,592,399；其配对序列位于3号染色体p13区域，位置为+71,869,882-71,870,107。通过使用UCSC基因组浏览器（2009年2月发布的GRCh37/hg19版本）对配对序列进行BLAST比对，确定其身份。结果表明，chr3p13位点的配对基因为PROK2。
同样，ABL-M2 相关的配对位于 chr5q21.1，而克隆 ABL-M3 被鉴定为靠近该区域的染色体内关联 ABL-1 位点
2. 使用ACT检测法确定低频长程相互作用
基于 3C 的其他检测方法已报道了比我们在图1及 Igf2/H19 位点所示更多的相互作用伙伴12。我们所概述的方法将筛选出最普遍的长距离相互作用。然而，通过增加 PCR 循环次数，也有可能鉴定出其他频率较低的关联（图2）。
3. 癌细胞与正常组织相比在长程相互作用上的差异。
ACT 检测还可用于识别正常细胞与癌细胞之间在细胞核结构和远距离相互作用上的差异（图3）。这些差异可能反映了细胞转化过程中发生的细胞核结构变化，因此该检测最终可能适用于诊断目的。在正常组织和癌组织中出现的相似凝胶图谱表明，ACT 检测具有可靠性和可重复性。尽管 ACT 检测能够识别远距离的 DNA 配对伙伴，但仍需进一步分析（如 FISH 和 ChIP 检测）来验证所鉴定的远距离位点之间的关联。随后可开展遗传学、生理学和生物化学研究，以阐明这些远距离 DNA 关联的生物学意义。
图1 在HL-60细胞中以ABL-1区域作为诱饵DNA进行ACT检测。a. ABL-1区域的DNA结构。ACT检测中使用的第一种限制性内切酶为Bgl II。第二轮PCR的引物也用箭头及相应的引物编号标出。b. 5%尿素-PAGE中ACT检测的凝胶图谱。巢式PCR中，引物对4626/2961用于扩增克隆ABL-M1，4630/2961用于扩增克隆ABL-M2，4636/2961用于扩增克隆ABL-M3。c. 克隆ABL-M1的DNA序列。ABL-1诱饵DNA来源的DNA片段以红色标注，其相互作用的DNA配对片段以青色标注。Bgl II位点（AGACTC）以绿色标注，Msp I位点（CCGG）以紫色标注。
图2 PCR循环次数影响ACT实验结果。 以小鼠成纤维细胞中Igf2/H19位点的印记控制区（ICR）作为 bait DNA，在ACT实验的第一轮和第二轮PCR中采用不同的循环程序。第一轮PCR进行18-20个循环时，扩增信号不足，无法观察到条带；第二轮PCR进行25个循环可产生清晰的条带，而增加第二轮PCR的循环次数则在出现更多条带的同时伴随拖尾现象。
图3 ACT实验中检测正常结肠组织与结肠癌组织间核结构差异。a. IGF2/H19 位点处ICR区域及IGF2基因的DNA结构。DpnII在ACT实验中的酶切位点已标注。第二轮PCR所用引物以不同颜色的箭头和数字标注，对应于图b中各泳道。b. ACT实验在5%尿素-PAGE凝胶中的电泳图谱。正常结肠组织MAD03-1423和结肠癌组织MAD04-149来自合作人类组织网络（CHTN）西部部门。每份结肠组织经匀浆处理后，按本文所述步骤进行ACT实验。泳道1代表使用引物对#2961和#4161（5'-tctgcgccatcagggcagtgagac-3'）的PCR结果，该引物对在图a中以粉红色标注；泳道2代表使用引物对#2961和#4163（5'-gccgcgcggccacttccgattcc-3'）的PCR结果，该引物对在图a中以橙色标注；泳道3代表使用引物对#2961和#5145（5'-gccatgcaggtaggatttgagctg-3'）的PCR结果，该引物对在图a中以蓝色标注；泳道4代表使用引物对#2961和#5151（5'-gtctcaaataggggccagctagcttgg-3'）的PCR结果，该引物对在图a中以绿色标注。仅在正常结肠组织中出现的独特条带以黄色箭头标注，仅在结肠癌组织中出现的条带以红色箭头标注。ICR，印记控制区；DMR，差异甲基化区。
讨论
Dekker 等 开发了染色体构象捕获（3C）技术，用于检测两个基因组位点之间相互作用的频率1，该技术已被广泛用于研究哺乳动物细胞中两个已知DNA区域之间的染色体内和染色体间关联2-9。尽管新发展的Hi-C方法可用于全基因组DNA关联研究，ACT检测仍是一种研究位点特异性DNA相互作用的有效技术10-11。我们对该方法进行了改进，以鉴定在培养的小鼠和人类细胞中与已知DNA区域相关联的未知DNA区域（图1）。我们将该方法命名为“关联染色体捕获”（associated chromosome trap, ACT）检测，因为它为我们提供了一种可靠且可重复的方法，用于鉴定与已知靶DNA区域相关联的新的未知DNA伙伴序列12。在实施ACT检测的新颖步骤之前，需先完成包含适当对照的成功的3C检测13。为了尽可能多地发现相关联的DNA区域，有必要使用多种第一和第二限制性内切酶的组合。尤其重要的是，在进行首次3C连接步骤时，应选用对CpG甲基化不敏感的限制性内切酶。蛋白质结合和DNA甲基化也可能影响限制性内切酶的消化效率，导致某些酶切条件下相关DNA区域无法有效连接。染色体内或染色体间的连接发生情况取决于蛋白-DNA交联以及两个相关DNA区域的适当物理图谱。因此，一些初步实验对于确定ACT检测中可行且有效的甲醛浓度和处理时间至关重要。在不同实验室中，3C步骤所使用的甲醛终浓度范围通常为1.5%至2%7,9。此外，也可将用作连接子的寡核苷酸设计为与第二限制性内切酶切割产生的黏性末端相匹配。尽管我们发现第一轮PCR进行18–20个循环、第二轮PCR进行20–25个循环即可获得清晰条带，但仍需为每个实验建立最佳PCR条件（图2）。在PCR过程中，DNA链的5'端和3'端互补接头序列之间可能发生分子内退火，这会抑制接头特异性引物与DNA分子的结合，导致最初几个循环的扩增效率显著降低。随着目标DNA经过多轮扩增，其数量可能远超过非特异性反应产物，从而促进引物优先与目标DNA分子结合。这也是为何会出现背景扩增，以及为何第一轮PCR产物必须稀释以降低背景信号的原因。为降低第二轮PCR中的背景信号，从PCR反应体系中去除过量引物非常重要。与所有基于PCR的实验一样，设计引物时必须避免位于重复序列区域，因为这些区域构成了人类和小鼠DNA的大部分。尽管新发展的Hi-C方法可用于全基因组DNA关联研究，ACT检测仍是一种研究位点特异性DNA相互作用的有效技术。
致谢
我们非常感谢Adelle Murell和Wolf Reik分享他们的3C实验方案。本工作由美国国防部和退伍军人事务部研究服务局资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| RPMI1640 培养基 | Invitrogen | 22400-105 | |
| 丙烯酰胺 | Invitrogen | 15512-023 | |
| ATP 溶液，10 mM | Invitrogen | AM8110G | |
| 胎牛血清 | Invitrogen | 16000-044 | |
| 青霉素-链霉素 | Invitrogen | 15140-122 | |
| 1 M Tris pH 8.0 | Invitrogen | AM9856 | |
| RNase A | Invitrogen | 12091-039 | |
| SDS | Invitrogen | 15525-017 | |
| 尿素 | Invitrogen | 15505-035 | |
| BamH I | New England Biolabs | R0136T | |
| Bgl II | New England Biolabs | R0144M | |
| Dpn II | New England Biolabs | R0543T | |
| Msp I | New England Biolabs | R0106S | |
| dNTPs | New England Biolabs | N0447L | |
| 蛋白酶 K | New England Biolabs | P8102S | |
| T4 DNA 连接酶 | New England Biolabs | M0202T | |
| 37% 甲醛 | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| 双丙烯酰胺 | Sigma-Aldrich | 146072 | |
| 二硫苏糖醇 | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| 甘氨酸 | Sigma-Aldrich | 50046 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 93482 | |
| 蛋白酶抑制剂 | Sigma-Aldrich | S8830 | |
| Nonidet P-40 | Roche Group | 11754599001 | |
| KlenTaq1 | Ab peptides | 1001 | |
| dCTP alpha P32 | PerkinElmer, Inc. | BLU513H250UC | |
| PTC-100 热循环仪 | MJ Research | mjptc100 | |
| 电泳电源 | Bio-Rad | 164-5056 | |
| OmniPAGE Maxi | Aurogene Life Science | VS20D | |
| Typhoon 9400 | GE Healthcare | 63-0055-78 |
参考文献
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重印与许可
