体内 犬肌肉功能检测

摘要

我们介绍一种微创且无痛的方法，用于测量犬后肢肌肉力量以及肌肉对重复离心收缩的反应。

摘要

我们描述了一种微创且可重复的方法，用于测量犬后肢肌肉力量以及肌肉对重复离心收缩的反应。将麻醉后的犬后肢固定于立体定位架上，使胫骨与股骨呈直角。用粘性绷带将足部固定在安装于伺服电机轴上的踏板上以测量扭矩。经皮神经刺激可激活足部的后肢肌肉，使其对踏板施加推力（伸展）或拉力（屈曲），从而产生等长扭矩。经皮胫神经刺激可激活胫距伸肌。通过经皮腓神经刺激，可诱导胫距屈肌产生重复的离心（拉长）收缩。离心收缩方案包括一次初始的等长收缩，随后由伺服电机施加强制拉伸。该旋转过程在肌肉收缩的同时使其被拉长，即为离心收缩。在刺激过程中，屈肌经历800毫秒的等长收缩和200毫秒的离心收缩。该过程每5秒重复一次。为避免疲劳，每完成10次收缩后休息4分钟，共进行30次收缩。

方案

1. 实验准备工作

1. 启动动态肌肉控制（Dynamic Muscle Control，DMC）软件。
2. 按照制造商的说明开启生理实验系统。
3. 运行 DMC 软件：

假设硬件已连接至运行 DMC 软件的计算机，并且系统已完成校准。该软件可能会不时更新，因此以下提供的操作说明适用于我们当前使用的软件版本。启动软件后，程序即处于运行状态。

用户可首先在 DMC 中编写一个刺激方案（例如，以 50 Hz 刺激 1.5 秒以产生等长强直收缩），然后将该方案保存以供后续使用。我们采用两种标准方案：（1）等长收缩方案（例如单收缩或强直收缩）；以及（2）离心拉伸损伤方案。我们首先使用等长收缩方案进行单收缩实验。为优化单收缩效果，需使用“监测输出”界面；在移动电极时可实时观察单收缩过程中产生的力矩。当获得最大单收缩反应时，返回主界面（选择继续），然后选择开始和完成以采集数据。文件通过另存为弹出窗口进行保存。保持电极位置不变，随后采集并保存强直收缩（50 Hz）数据。完成所有等长收缩实验后，可加载并运行离心拉伸损伤方案。由于该方案包含一系列收缩（共10次收缩），在主界面上需选择运行一次按钮以显示“运行全部”状态。此时选择开始后，将弹出运行全部方案窗口，提示输入根文件名及文件保存目录。随后选择启动方案序列测试和完成，以启动离心拉伸损伤方案。文件将自动保存至所选目录中。

2. 将动物放置于生理实验装置中

1. 所有涉及动物的操作均须遵循动物护理与使用委员会（ACUC）的指导原则。
2. 根据批准的方案，使用吸入麻醉（如异氟烷）对犬进行麻醉。通过检查眨眼反射确认动物已处于深度麻醉状态。在整个操作过程中应密切监测 CO₂、脉搏血氧饱和度和体温。我们通常使用丙泊酚进行诱导麻醉，随后以七氟烷维持吸入麻醉。
3. 剃除将要放置刺激电极部位附近的外侧膝关节（膝盖）区域的毛发（即从腓骨头开始，沿肢体外侧向远端延伸至大转子下方 2–3 cm 处）。
4. 将犬仰卧位固定于生理实验台，调整后肢位置，使股骨与胫骨成直角，且胫骨与台面平行。可选择右侧或左侧肢体进行测试。
5. 在将犬的足爪固定于力踏板之前，应检查确认力踏板周围无障碍且可安全旋转。按照生理记录系统的开机程序启动设备并激活踏板。注意：当手动尝试移动踏板时，其应表现为“僵硬”状态。
6. 轻柔地将犬的足爪放置于踏板上；测量并记录从旋转中心轴至外侧脚趾末端的足爪长度。
7. 使用弹性自粘绷带将足爪牢固固定在踏板上。

3. 等长收缩抽搐力矩（胫跗关节屈曲）

1. 完成安全检查后，将无菌屏蔽式单极24号刺激电极连接至刺激隔离单元（SIU）。
2. 将刺激器设置为：1 Hz（每秒1次脉冲）的连续脉冲输出。
3. 软件设置：加载等长收缩实验方案（在主屏幕上选择加载方案）。此时运行一次按钮应显示在开始按钮旁边。此设置确保方案仅执行一次。
4. 戴手套后，用酒精清洁皮肤，并触诊腓骨近端外侧稍下方的腓总神经。用手指标记神经位置后，小心地将阴极（黑色）电极插入皮肤下方，紧邻骨膜外侧。电极应平行于皮肤表面，插入深度约为2 cm，以确保移开手后电极不会移动。
5. 将阳极（红色）电极插入皮肤下，与阴极电极平行且略偏远端。此时两个电极均应位于腓骨小头稍下方的腓总神经内侧。
6. 以1 Hz频率启动刺激器。在显示器上观察肌肉颤搐反应。微调电极位置以获得尽可能大的颤搐波幅。为找到最大颤搐反应，应将电极完全拔出，并沿胫骨方向每次移动约0.5 cm，重复插入3至4次，每次均平行于胫骨。这是该操作的关键步骤，必须仔细寻找最大反应。
7. 记录颤搐反应：退出监测输出界面（选择继续），然后依次选择开始和完成以采集数据。在弹出的另存为窗口中，使用所需文件名保存文件。关闭刺激器。

4. 等长强直性力矩（胫跗关节屈曲）

1. 在不移动电极的情况下，将刺激器参数设置为 50 Hz，持续 1.5 秒，并启用外部触发功能。此设置可使刺激器由软件控制启动。
2. 软件设置：使用相同的等长收缩实验方案来采集强直收缩反应，方法与采集单次收缩相同。假设刺激电极位置未发生移动，则选择开始和完成以产生强直收缩。在等长收缩实验方案中，软件将触发刺激器以确保精确的时序控制。在另存为弹出窗口中保存强直收缩反应数据。

5. 偏心训练方案

1. 不移动电极的情况下，将刺激器设置更改为：50 Hz，持续1秒（100V），并启用外部触发功能。这将允许软件激活刺激器。
2. 软件设置：加载eccentric stretch injury protocol，该指令使伺服电机旋转29度（最大为30度）。选择Run All，然后选择Begin；输入偏心收缩系列文件的根文件名及其保存路径文件夹。选择Start Protocol Series Test，再选择Done以启动该实验流程。
3. 在此流程中，刺激器被设置为由软件触发，以保持精确的时间同步。每次偏心收缩的反应出现在屏幕上时，系统将自动保存数据。
4. 每完成十次偏心收缩后，需进行四分钟的休息。
5. 共采集30次偏心收缩（分为三组，每组十次收缩，组间间隔四分钟休息期）。

6. 等长收缩肌力矩（胫跗关节伸展）

1. 重复上述抽搐刺激方案，但将电极垂直于皮肤放置，并位于原屈曲刺激方案电极位置的近端。胫神经在其穿过腓肠肌肌腹向尾侧和远端走行时被刺激。成对的刺激电极和参考电极应置于膝关节后方肌肉深层，位置在膝关节（膝）稍近端且偏尾侧。大致放置位置位于平分膝关节（膝）所形成的90°角的直线上。由于胫神经位于腓总神经的更深层（且偏尾侧），需将电极置于多个区域以诱发最佳的抽搐电位。这是该操作的关键步骤。注意：胫跗关节抽搐和强直收缩的扭矩记录曲线将相对于胫跗关节屈曲记录曲线呈现倒置形态。

7. 等长强直性力矩（胫跗关节伸展）

1. 在不移动电极的情况下，将刺激器参数调整为 50 Hz，持续 1.5 秒，并启用外部触发功能。此设置可使刺激器由软件控制启动。
2. 软件设置为：50 Hz，持续1.5秒，并启用外部触发功能。此设置可使刺激器由软件激活。
3. 软件设置： 相同的等长收缩方案 用于强直收缩的刺激电极与用于单收缩的相同。假设刺激电极未被移动， 开始 和 完成 用于产生强直收缩。
4. 在等长收缩实验方案中，通过软件触发刺激器以维持精确的刺激时序。在弹出的“保存文件”窗口中保存强直收缩反应数据。

8. 数据分析

1. 使用 Aurora Scientific 公司的动态肌肉分析（DMA）程序获取来自单次收缩、强直收缩和离心收缩的力矩及时间信息。
2. 运行 DMA 程序：软件可能会不时更新，因此以下说明适用于我们当前使用的软件版本。打开 DMA 软件时，程序并未运行。要启动程序，请点击左上角的白色箭头按钮。DMA 软件具有多种功能，但在此仅介绍与我们实验目的相关的若干功能。
   加载要分析的文件： 重新加载最近的数据文件还是新的数据文件？ 启动 DMA 程序时会弹出窗口。 选择 新；在下一个窗口中选择 Labview；在下一个窗口中，选择相应的文件夹和文件；选择 开放选择 移除滤光片图 以移除此窗口。输入一个滤波频率 截止频率 盒。最佳滤波频率需根据待评估的具体数据确定。例如，我们对等长反应使用30 Hz，对离心反应使用10 Hz。选择 使用过滤后的数据 按钮。在下方 选择绘图数据，选择 过滤力使用底部的两个滑动条来扩展显示并浏览文件。
3. 抽搐分析（图1）：假设文件已加载且上述步骤已完成，设置光标位置：共有 3 个光标：（1）蓝色，（2）黄色，（3）白色。对于等长抽搐、强直收缩或其他等长收缩，蓝色光标应置于力矩从静息力矩开始上升的点；黄色光标置于力矩恢复至静息力矩的位置（即松弛相结束后）；白色光标置于黄色光标右侧（非必需）。按住鼠标左键并拖动所选光标，即可轻松将其移动至目标位置。
   执行分析：当光标定位后，选择 进行肌肉分析，然后 显示结果。在 分析肌肉数据结果 弹出窗口中会显示多个变量，例如 最大力 ; 基线 力 ; ½ 弛豫时间数据展示范围位于光标1（蓝色）和光标2（黄色）之间的扭矩响应。所有这些变量或特定变量均可记录到数据文件中；但本文不描述该过程。若未设置数据记录，则需手动记录数据。选择 关闭窗口 返回主屏幕。选择 退出程序 关闭 DMA，然后选择白色箭头以开始分析新文件。
4. 强直收缩分析（图 2)：与上述抽搐实验相同的步骤。
5. 偏心分析（图 3）：偏心分析需要更多的设置步骤，并且使用全部3个游标。如果偏心力矩反应为负值（即力矩曲线显示为向下方向），可通过输入-1将其反转 参考区域（平方厘米） 箱（扭矩值保持不变）并选择 不要归一化；按钮状态反转，表示数据已完成归一化处理（本例中为取反）。输入所需 截止频率 （例如，10 Hz）并选择 使用未过滤的数据 反转按钮 使用过滤后的数据，现在将使用过滤后的数据进行分析。将蓝色光标置于等长收缩力矩开始从静息力矩上升的点；将黄色光标置于偏心拉伸力矩开始从等长平台期上升的点（见下图）；将白色光标置于力矩恢复至静息力矩的位置。选择 进行肌肉分析，然后 显示结果在“分析肌肉数据结果”弹出窗口中，可选择光标1（蓝色）和光标2（黄色）之间的等长扭矩数据，或光标2（黄色）和光标3（白色）之间的离心扭矩数据。所有这些变量或特定变量均可记录到数据文件中；但本文不描述该过程。若未设置数据记录，则需手动记录数据。选择 关闭窗口 返回主屏幕。选择 退出程序 关闭 DMA，然后选择白色箭头以开始新文件的分析。

9. 代表性结果

1. 抽搐力矩：胫神经刺激（1 Hz）可激活胫距伸肌产生单次抽搐（图1）。请注意，Y轴表示“力”；力矩（力与距离的乘积）需由用户自行计算。我们测量足掌长度（从旋转轴至外侧脚趾末端），该长度即为计算力矩（N·m）所用的距离（力臂）。
2. 等长强直力矩（胫距伸展）：通过胫神经刺激使胫距伸肌产生强直收缩（50 Hz脉冲，持续1.5秒）。我们使用动态肌肉控制计算机软件（DMC，Aurora Scientific, Inc.）控制刺激时序并记录力矩反应（图2）。
3. 离心收缩方案：离心收缩在胫距屈肌中进行。经皮腓总神经刺激引发初始的等长收缩，随后关节旋转导致激活的屈肌被拉长，从而产生离心收缩（图3）⁶。

图1. 用于分析一次肌肉抽搐的蓝色（#1）、黄色（#2）和白色（#3）游标的放置位置。图中显示的是在一只健康的13 kg犬中，胫跗关节伸展抽搐时DMA软件的代表性界面截图。请注意，在软件进行后续分析时，数据会被导出至电子表格，且力输出值（图中显示为Force (g)）可转换为扭矩（N-m）。扭矩通过力与力臂距离的乘积计算得出（本例中，力臂距离 = 从旋转轴到足垫外侧脚趾所测得的长度）。

图 2. 放置蓝色（#1）、黄色（#2）和白色（#3）游标以分析一次强直收缩。图中显示了DMA软件的代表性截图，用于胫跗关节伸肌强直收缩分析，动物与图 1中所示为同一只。

图3. 蓝色（#1）、黄色（#2）和白色（#3）游标的位置，用于分析一次离心拉伸损伤性收缩。图中显示了在一只健康的13 kg犬中进行单次离心拉伸损伤性收缩时，DMA软件的代表性界面截图。初始平台期（绿线）表示收缩的等长相。等长相之后是离心（拉伸）相，表现为绿线的快速峰值。重复的离心收缩通常会导致等长力矩持续下降。

讨论

本方案用于在活体条件下评估大型动物肌肉功能，以分析、记录和确定治疗干预措施的有效性，或记录疾病进展过程中的生物学特征。^1-6 动物体位、肢体放置和电极位置是显著影响实验结果的关键变量。在一项初步研究中，异氟烷的平均肺泡浓度（MAC）值对力量测量结果无显著影响（Schueler RO, Koch H, Kornegay JN，未发表数据，1993年）。相关硬件和软件均为市售产品，方法成熟可靠。^{7,1,2,8,4,9-11,6,12} 建议使用者在执行本方案时获取并使用上述描述的软件和设备。

改进：当前伺服电机的局限性包括约23公斤的体重和20厘米的足掌长度。请注意，此处描述的扭矩传感器（型号310LR）的扭矩限制约为8 N·米。正常犬只在6个月或更大年龄时可能超过此值。对当前方案可能的改进包括更新软件以及提高传感器的扭矩范围。Aurora Scientific公司生产一种适用于大型动物的肢体定位装置，可替代本方案中使用的立体定位仪。该方法已成功应用于其他动物模型，包括非人灵长类动物。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
刺激电极	Teca	25毫米×26G	一次性无菌单极针电极
刺激器	草本科技	S88X
刺激隔离单元	草本科技	SIU-C
肌肉杠杆系统	Aurora Scientific	310C-LR	底板选项
信号接口	Aurora Scientific	系列 604A
动态肌肉控制 &分析软件	Aurora Scientific	Aurora Scientific
电脑/显示器	Aurora Scientific	Windows XP 计算机
肢体位置固定装置	Aurora Scientific	NA	可替代立体定向框架
表格	Northstar Customs, LLC	NA	定制桌
用于足部固定于踏板的柔性绑带	安多弗	PetFlex(5 cm × 2 m)	可重复使用一至两次