本指南逐步介绍了新型重力力谱仪的原理、操作方法及典型实验结果。
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摘要
摘要
大分子结构的研究对于阐明分子机制和功能已变得至关重要。目前存在一些虽有限但重要的生物仪器，能够检测蛋白质结构特征对力的依赖性。尺度一直是制约研究人员准确观察分子纳米力学世界（如执行维持生命功能的核酸、酶和马达蛋白）的一个参数。原子力显微镜（AFM）非常适合测定纤维状蛋白质的天然结构，其距离分辨率可与电子显微镜相媲美。然而，在AFM的力研究中，所施加的力通常远高于单个分子在生理条件下可能经历的力1, 2。光镊（OT）在测定被捕获微珠之间相对距离方面表现优异，并且能够施加极小的力3。然而，它们无法提供被研究分子的精确绝对长度。分子模拟可为这类实验提供支持性信息，但在处理相同的大分子尺寸和长时间尺度方面存在局限性，且在缺乏其他实验证据支持时，难以让部分研究人员信服2, 4。
重力力谱仪（GFS）通过提供一种独特的能力组合，在研究者可用的工具中占据了一个关键位置。该仪器能够生成通常具有98%或更高精度的力，范围从飞牛顿到纳牛顿。目前，其距离测量能够分辨低至五纳米的绝对分子长度，并以与光镊相当的精度测量微珠对之间的相对分离距离。此外，GFS可以在力接近平衡状态时确定拉伸或解折叠过程，或提供梯度力以与任何测得的结构变化进行对比。甚至可以在生理力负荷下确定参与解折叠事件的氨基酸残基数量2。与其他方法不同，其他方法在进行任何检测前通常需要大量力校准，而GFS则无需此类力校准5。通过补充其他方法的优势，GFS将有助于填补人们对重要蛋白质及其他大分子纳米力学机制理解上的空白。
方案
新型GFS构型简介
GFS 包含若干关键组件：一台普通光学显微镜、一个赤道仪、一台相机和一台计算机 [图1]。根据 GFS 的设计，用于承载样品的密封流动池腔室也是必不可少的。光学显微镜安装在赤道仪上，从而使显微镜可在空间中旋转至不同方向。这种能力使得可以利用静态的重力矢量，使样品相对于该矢量进行动态取向，从而使重力对样品施加皮牛顿（piconewton）量级的力。相机取代了光学显微镜的目镜，以便记录样品取向的变化。这些原始数据被计算机数字化并处理，从而转化为实际的力和距离测量值。密封流动腔室的设计允许样品在空间中具有全部自由度，同时防止样品丢失。腔室内包含待测样品分子，该分子的一端连接到一个“固定的”微珠，该微珠被粘附在腔室表面；另一端则连接到一个“可移动的”微珠，该微珠未与腔室表面接触，可在溶液中自由移动。正是这个在检测缓冲液中自由存在的可移动微珠，能够受到重力作用，从而在极低的力载荷下拉伸被固定的分子 [图2]。在显微镜下，样品看起来仅是一对微球，尽管需要一定经验才能区分出那些通过分子连接而形成的、可用于实验的有效微球对，与两个微珠均沉降在流动腔室表面的无效组合。系统的一种改进方案是增加一个由弹簧悬挂的浮动平台，GFS 整体安装于该平台上。在此配置中，当样品被旋转至重力可作用于其上的位置后，整个平台及其组件可沿弹簧的弹性方向进行下落运动。在接近自由落体时，作用于可移动微珠的力接近于零；而在弹簧达到最大伸展时，重力作用可被放大至约两倍。通过这种方式，可绘制出分级的力-距离响应曲线，用于测量单个分子在不同力载荷下的行为特征。
1. 微球制备
- 将约 10 mg 玻璃珠或二氧化硅珠浸入 0.04% 3-氨基丙基三乙氧基硅烷（用丙酮稀释）中，持续两分钟。
- 用两次双蒸水冲洗，并在 2000 × g 条件下离心 5 分钟以形成沉淀。弃去上清液。
- 加入 5 mL 偶联缓冲液（0.01 M 吡啶用双蒸水稀释，并调节 pH 至 6.0），剧烈振荡混合物。按上述方法离心。重复此步骤三次。
- 向湿润的珠沉淀中加入 2 mL 5% 戊二醛溶液（用偶联缓冲液稀释戊二醛）。剧烈振荡。
- 在通风橱内，将珠子与戊二醛混合物于室温下旋转孵育 3 小时。
- 按上述方法离心并吸除上清液。
- 用 5 mL 偶联缓冲液洗涤珠子，剧烈振荡后离心并吸除上清液。再重复此步骤三次。
- 向珠子中加入约 15 μL 目标抗体，并剧烈振荡。珠子需旋转孵育 16–24 小时。
- 在通风橱内，加入 5 mL 1 M 甘氨酸淬灭液（用双蒸水稀释甘氨酸，并调节 pH 至 7.0）。剧烈振荡混合物，并旋转孵育 30 分钟。
- 离心并吸除上清液。
- 加入 5 mL 洗涤缓冲液（0.01 M Tris，pH 7.0；0.1% 叠氮化钠；0.1% BSA；0.15 M NaCl；以及 0.001 M EDTA）。剧烈振荡，离心后吸除上清液。再重复此步骤三次。
- 更换为低盐缓冲液（0.1 M KCl；0.02 M 咪唑；5 mM MgCl2；调节至 pH 7.0）。重复洗涤三次。
2. 样品与微球的连接
- 取少量制备好的磁珠（每块磁珠约 2 μL；但如果不同批次间磁珠直径差异较大，则建议使用大磁珠与小磁珠约 8:1 的比例），加入含有检测缓冲液的微量离心管中。用检测缓冲液将蛋白浓度调整至约 5 μM。总体积至少准备 400 μL，包括缓冲液、蛋白和磁珠。
- 将该混合物在约 1 RPM 条件下旋转孵育 3 小时（若蛋白受到过度震荡，会发生聚集而失去活性）。
3. 载玻片腔室制备
- 用0.01%硝酸纤维素（溶于乙酸戊酯）包被厚显微镜载玻片。让该载玻片干燥约10分钟。
- 使用锋利的玻璃切割器将盖玻片切割成四个玻璃条，以形成一个腔室。
- 利用玻璃的原厂边缘，在边缘两侧的真空脂涂膜上来回刮擦。
- 将涂有真空脂的玻璃条压到已干燥的硝酸纤维素包被的载玻片上，在载玻片表面形成一个方框结构。
- 通过轻敲移液器，将约2 μL的微珠/蛋白质混合液滴加到方框内的玻璃表面。
- 根据腔室大小，加入约20–400 μL的低盐缓冲液。
- 将一张盖玻片压在已涂有真空脂的方框顶部，完成密封并缓冲的腔室构建。
- 将载玻片置于水平位置静置，使微珠有充足时间锚定在硝酸纤维素表面。
4. GFS 数据采集
- 将载玻片安装到 GFS 载物台上
- 监测 GFS 相机所记录的图像，并寻找有效的“珠对”，即小微球附着在大微球赤道附近的位置。
- 当发现潜在的珠对时，调节焦深以确认“可移动”微球并未接触载玻片表面。
- 一旦确定合适的珠对，记录可移动微球相对于 dmax 的角度（dmax = 耦合微球质心之间的最大距离）。将显微镜调整至合适位置以开始录像。
- GFS 的移动角度应足够大，以记录 dmin、dmax 和再次回到 dmin 的全过程，具体角度可能为 25–90 度，取决于分子长度。
- 在珠对从 dmin 移动到 dmax 再返回 dmin 的过程中进行录像。
- 建议同时拍摄背景视频，以便后续分析时进行背景扣除。
- 若进行 GFS 滴落实验，将显微镜移回 dmax 位置，并以每秒至少 60 帧的速度记录滴落过程。关键部分是第一次振荡，但较长的记录时间也可用于动力学研究。
5. GFS 数据分析
- 将原始视频转换为数字“阈值化”图像，并在 ImageJ 中运行宏，以确定视频每一帧中每个微珠的质心位置。此步骤同样适用于下落实验的视频。
- 将 ImageJ 输出的 X、Y 坐标及面积数据导入 Excel，并绘制数据点。
- 若视频成功捕获到一对合适的微珠，则图表中会出现明显的隆起峰形，该峰的最低点表示微珠间距最近（dmin），而峰顶位置对应 dmax。
- 利用这些数据，应在 ImageJ 中精确测定每个微珠的半径，并将所有信息代入以下嵌套公式：
d = [(g sin α)2 + (g cos α + dmax - g)2]0.5
g = [dmin2 + rb 2 - (ra + rb)2]0.5 = rb sin β
c = dmax - ra - g
（d = 质心间距；g = 重力；α = 与物镜平行方向的角度，单位为度；rb = 可移动微珠的半径；ra = 固定微珠的半径；β = 固定微珠赤道轴线上的附着角度）。 - 利用拟合得到的可移动微珠半径，可进一步计算其体积，结合微珠的密度，在扣除溶剂浮力后，即可计算出该微珠作用于分子的力，单位为皮牛顿（piconewtons）。该方法以皮牛顿为单位测量连接分子所受的力，并以纳米为单位计算抗体结合位点之间的绝对分子长度。F = V (d-b) a（F = 力，V = 体积，d = 玻璃微球的密度，a = 重力加速度，b = 被排开的水的密度）。
6. 代表性结果：
如果微珠制备操作正确，微珠的聚集现象应最少，尽管仍可能存在少量微珠团块。在显微镜下观察时，无论成对与否，微珠在腔室中应呈现较为均匀的分布。
应尽可能减少振动；为此，可使用气浮平台、为承载赤道仪的三脚架设计的特殊减震脚垫，或采用弹簧结构的系统来实现隔振。
关于密封流动池的另一个实用技巧是，在其完全组装完成后，将其放置在水平桌面上静置约五分钟。这样可使任何未结合的大颗粒珠子通过缓冲液沉降，并停留在硝酸纤维素层中。如果组装完成后立即将载玻片安装使用，研究者将不断面临颗粒在视野中快速移动的干扰；若在视频采集过程中发生此情况，可能会破坏实验结果。若正确执行此步骤，颗粒的移动将显著减少，从而获得更清晰的视频图像。
当GFS操作员识别到一对潜在的微珠时，对其进行初步旋转以监测该微珠对的行为是很有必要的。偶尔，较大的微珠并未牢固地固定在载玻片上。如果发生这种情况，则该微珠对无法用于实验，因为在整个数据采集过程中，必须确保较大的固定微珠保持位置不变。如果微珠对稳定，且未出现“固定微珠滚动”现象，则适合用于实验。
绘制小球间距相对于重力方向角度变化的曲线可用于评估所获得的数据。理想情况下，当移动小球尚未脱离锚定小球时，曲线在平台期应显示较小的间距；随着重力作用使移动小球逐渐脱离锚定小球，曲线将显示出逐渐增大的间距。该趋势持续至达到一个明显的峰值，即 dmax，随后曲线再次下降并回归至基线 dmin [图1]。在理想条件下，该特征曲线呈对称形态。非代表性结果则可能表现为图形模式混乱，缺乏清晰的 dmin-dmax-dmin 变化规律；或显示间距过大，超出单分子量级数个数量级，提示可能有灰尘颗粒夹在小球之间，或移动小球根本未与分子连接。在整个流程中，从寻找小球对、拍摄、处理到分析，存在多个质量控制环节，用于剔除不合格的小球对。因此，若完成全部流程后所得分子长度与先前结果一致，则可高度确信原始小球对具有代表性，可纳入最终结果。在实验条件良好的情况下，大约一半被拍摄的小球对可转化为有效的数据点。例如，基于电镜（EM）和原子力显微镜（AFM）数据，已知 MF20 与 MF30 抗体之间肌球蛋白卷曲螺旋结构的长度接近 100 nm 2,7,8,9。若实验结果为此长度的数倍，则表明样品发生了聚集。本文展示的结果来自标准 GFS 旋转实验，测得距离为 96 nm ± 5 nm [图2]，与文献报道的 MF30（结合于肌球蛋白亚片段-2 的 N 末端）与 MF20（结合于轻酶解肌球蛋白区域）抗体在肌球蛋白上的间距测量值高度一致 [图3]。
图1. GFS 构型。GFS 的主要部件已标注。
图2. GFS原理示意图。左侧显示移动微珠的质心与固定微珠的质心之间距离最短。当GFS旋转时，移动微珠会与重力矢量对齐，而该重力矢量同时与被拴系分子的轴平行。在此位置，移动微珠与固定微珠质心之间的距离达到最大。右上方显示一段典型的GFS视频切片图像。右下方为GFS进行旋转时的图像。
图3. 典型结果显示，在图左侧为 dmin；在珠子间相对间距为17.78微米时达到 dmax；当相对间距回到约17.75微米的基线附近时，dmin 再次出现。
图 4. GFS 旋转实验的代表性结果，显示 MF20 与 MF30 抗体之间的平均距离为 96 nm，代表 S2 的近似长度。
图 5. 使用肌球蛋白 II 二聚体以展示可用于光镊系统的连接方式，包括抗体和/或肌动蛋白连接。不同的连接方式可实现多种光镊实验策略，用于测量不同区域，或在垂直或平行于肌球蛋白二聚体杆状结构域的方向上施加力。
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讨论
在将视频转换为数字阈值化图像时，保持每帧图像中阈值化区域面积的一致性至关重要。由于成对微球中的两个微球彼此独立运动，阈值化区域的任何漂移都可能导致微球质心间相对距离的漂移，从而引入显著误差。通过控制阈值化区域面积，距离测量的误差从26 nm降低至5 nm，减少了五倍。此外，准确测量两个微球的半径也至关重要，因为微球之间的半径比值对最终计算距离和力的数值具有重要影响。
该系统可通过多种方式进行改进。最新的系统通过将整个重力反馈系统（GFS）下落撞击一个已知弹簧常数的弹簧，从而向被拴系的分子施加梯度力。一旦确定了弹簧常数，就可以在显微镜视频采集的同时获取第三方视角视频，并将两个视频同步。随后，根据GFS在同步的第三方视角视频中下落时的位置，为显微镜相机拍摄的每一帧视频分配相应的力值。视频的每一帧都对应一个力值，该力值即为移动微珠在弹簧系统下落及后续反弹过程中所施加的力。同时，对每一帧视频进行分析以获得分子的绝对长度。通过这种方式，每一个离散的力值均可与一个离散的距离测量值相对应，从而生成一条梯度力/距离曲线，用于观察单个分子在逐渐增加的负载下的行为。该技术还可使微球所施加的力最高达到重...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本材料基于美国国家科学基金会资助项目编号0842736所支持的工作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 3-氨基丙基三乙氧基硅烷 | Polysciences, Inc. | 919-30-2 | |
| 丙酮 | Fisher Scientific | A18P-4 | |
| 吡啶 | Sigma-Aldrich | 110-86-1 | |
| 戊二醛 | Fisher Scientific | G7776 | |
| 甘氨酸 | 研究用有机物 | BP381-1 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | 9682T | |
| 叠氮化钠 | Amresco | 71289 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | AMR-0332-100G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| EDTA | 微卫星不稳定性 | E9884 | |
| 硝酸纤维素 | Sigma-Aldrich | 60443 | |
| N-N 二甲基甲酰胺 | 从大型新样本中提取 | D4254 | |
| 兔骨骼肌肌球蛋白II | 中国台湾白兔（7-8只） | NA | |
| MF30 抗体（9-10） | 发育研究杂交瘤库 | MF30 | |
| MF20 抗体（6） | 杂交瘤库 | MF20 | |
| 实验室显微镜 | 北方的 | WW57905M00 | |
| 赤道仪 | Celestron | CG-5 | |
| 数码摄像机 | 索尼公司 | XCDV60 | |
| Caliper 释放 | Cabelas | IA-415482 | |
| 压缩弹簧 | Jones Spring 公司 | 723 | |
| 拉伸弹簧 | Jones Spring 公司 | 770 | |
| ImageJ | 美国国立卫生研究院 | NA | |
| Fire-i 驱动程序 &和应用 | 优尼脑 | 3.80 | |
| Excel | 微软 | NA |
参考文献
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