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使用落射荧光显微镜和开源软件对秀丽隐杆线虫（C. elegans）胚胎进行成像

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DOI：

10.3791/2625

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2011年3月24日

 , 
1Human Genetics, University of Michigan

本文内容

摘要

C. elegans 胚胎是研究细胞生物学和发育过程的有力体系。本文介绍一种利用常见的落射荧光显微镜和开源软件，通过微分干涉差（DIC）光学或荧光技术对 C. elegans 胚胎进行活体成像的实验方案。

摘要

细胞过程（如染色体组装、分离和胞质分裂）本质上具有动态性。利用荧光标记的报告蛋白或微分干涉差（DIC）显微镜对活细胞进行延时成像，可实现对这些动态事件时间进程的直接观察，而无需依赖固定样本的分析进行间接推断。1,2此外，研究细胞过程在发育过程中的调控机制需要在生物体发育期间对其完整个体进行时间推移实验。 秀丽隐杆线虫 胚胎具有透明性，且拥有快速、稳定的发育程序，其细胞谱系已知3因此为研究细胞生物学问题提供了理想的实验模型4,5和发育6-9. 秀丽隐杆线虫 可通过正向遗传学（基于随机诱变）进行遗传操作10,11）以及利用反向遗传学靶向特定基因（基于RNAi介导的干扰和靶向诱变）12-15此外，可轻松创建转基因动物以表达荧光标记的蛋白质或报告基因16,17这些特征共同使得识别调控基本细胞和发育过程的遗传通路变得简便。 体内18-21在本方案中，我们介绍了活体成像的方法 秀丽隐杆线虫 使用微分干涉差（DIC）光学或GFP荧光在复合式落射荧光显微镜上对胚胎进行观察。我们展示了如何利用通常用于固定样品成像的现成显微镜，结合开源软件自动化成像过程，轻松实现延时成像分析。

方案

线虫制备

  1. 将L4期幼虫线虫转移至适当的培养板，成像前18-24小时进行22这将确保您获得产卵的成虫，以提供充足的早期胚胎。
  2. 准备凡士林和琼脂糖管。取若干15 mL离心管，将凡士林置于烧杯中用微波炉加热熔化，分装至各管，每管4–5 mL。同样，将2–3%（w/v）琼脂糖在缓冲液（M9或卵缓冲液）中熔化，每管分装4–5 mL至离心管中。加热过程中注意避免过度沸腾，以减少蒸发。成像当天，将1管凡士林在65–70°C 加热块中融化1管琼脂糖，放入微波炉加热时需注意避免剧烈沸腾。将试管存放于加热块中，以保持石蜡和琼脂糖处于熔融状态。
  3. 制备琼脂糖垫。将一张新的显微镜载玻片置于两片引导载玻片之间，引导载玻片的顶部和底部均贴有一层普通的实验室胶带。用去尖的巴斯德吸管吸取融化的琼脂糖，在新载玻片上滴加2–3滴。盖上一张2nd 将载玻片垂直于原始载玻片滑动，使其覆盖并帮助摊开琼脂糖，形成一层薄的方形垫。该 2nd 载玻片应置于导引载玻片的胶带上方。琼脂糖浓度可增至5%以制备更厚的凝胶垫。
  4. 使用解剖镜和铂金丝“接种针”，将2条成虫转移至一个9-12μL M9 或 Egg Buffer 的一滴，置于 18 mm × 18 mm 的盖玻片上。
  5. 用针头（我们使用27G1/2针头）或解剖刀切开线虫以释放胚胎。尽量在线虫的中部进行切割。
  6. 将低熔点琼脂糖凝胶垫（琼脂面朝下）放置在含有胚胎的18×18 mm盖玻片上。用刀片修剪超出盖玻片边缘的琼脂部分。
  7. 用毛笔或细木棒将熔化的石蜡涂抹在盖玻片的四条边缘以封固盖玻片。

如果胚胎对压力敏感（例如卵壳未能正常形成），可采用悬滴法代替琼脂糖封片法23。也可在体内（in utero）进行成像，以观察受精过程或减数分裂等早期事件。线虫应使用左旋咪唑（Levamisole）进行麻醉24。为了增加特定发育阶段的胚胎数量，可同时解剖多条线虫，并使用细尖移液器、睫毛刷或口吸移液法轻柔地将胚胎集中放置。

4D 诺马尔斯基微分干涉对比（Differential Interference Contrast）图像序列

  1. 打开 Olympus BX61 显微镜。由于相机对其他设备发射的电磁波敏感，因此应最后开启相机，而汞灯（如需进行 GFP 或荧光成像）则应首先开启。待所有设备启动后，启动 Micro-Manager 软件。根据需要选择适用于微分干涉差（DIC）或荧光成像的配置文件。主要区别在于，DIC 配置文件不包含对荧光快门的控制。每个配置文件还会自动选择相应的滤光片组和相机增益设置。
  2. 使用10倍物镜在显微镜下寻找胚胎。在蠕虫体附近寻找成簇的早期胚胎，以便在成像视野内获得多个胚胎。为获得最佳图像，应避免选择仍位于蠕虫体内的胚胎。
  3. 使用软件切换至更高倍数（40x 至 100x）和更高分辨率（数值孔径 0.9 至 1.4）的物镜进行成像。
  4. 调节诺马尔斯基微分干涉相衬光学系统（以下网站包含有关微分干涉相衬光学系统及其术语的有用解释； http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/dic/dichome.html
    http://microscopy.berkeley.edu/Resources/instruction/DIC.html
    1. 在我们的 Olympus BX61 上，重要组件包括：
      1. 偏振器——聚光镜下方的滑块
      2. 聚光镜沃拉斯顿棱镜——位于物台正下方聚光镜上的转塔。
      3. 目标：沃拉斯顿棱镜——滤光立方体下方的滑块
      4. 2nd 偏振器（检偏器）——微分干涉差（DIC）位置的滤光立方体
    2. 将滤光立方体切换至微分干涉相衬（DIC）以定位检偏器（2nd 偏振器）置于光路中（软件应在启动时执行此操作）。
    3. 确保两个偏振片正确对齐（正交）。当两个沃拉斯顿棱镜均移出光路时，视野应呈暗场。如有必要，旋转聚光镜下方的偏振片直至达到此状态。
    4. 将物方（上方）沃拉斯顿棱镜插入光路中。
    5. 旋转聚光镜上的转盘，选择与所用物镜匹配的渥拉斯顿棱镜。
    6. 调节此物镜下方的滑块以匹配镜头的数值孔径（NA）。
    7. 调节聚光镜以获得最佳科勒照明。
    8. 通过旋转滑块上的旋钮，调节上部沃拉斯顿棱镜以获得最佳对比度。
    9. 软件启动时控制的其他设置包括相机增益（设为0）以及将文件保存为8位而非16位的TIFF文件。
  5. 调节光照强度以获得理想的图像（通常使用4.7伏特，通过软件控制）。我们倾向于对样品进行照明，使最亮的像素略低于饱和水平。
    良好的微分干涉相差（DIC）光学效果会产生具有三维感的图像，其中胚胎中的卵黄颗粒清晰突出。或者可以描述为：照射样本的光线似乎从某一角度射入，使样本（或样本中的结构）一侧明亮，而相对的另一侧处于阴影中，显得较暗。
  6. 选择感兴趣区域（ROI）以包含您要成像的胚胎，单击设置 ROI 按钮以缩小窗口。
  7. 打开多维采集窗口，选择Z轴层扫描（切片）和时间点。
  8. 使用显微镜调焦旋钮找到胚胎底部（最后一个能清晰观察到部分卵黄颗粒的焦平面），点击“选择底部”。重复操作以确定并设定胚胎顶部。我们通常使用1微米的步长，最终获得约20个焦平面。由于胚胎和细胞相对较厚，我们通常在每个时间点采集多个焦平面图像。此外，当细胞开始以不同方向分裂时，尤其容易推动周围其他细胞，导致它们在胚胎内上下移动，从而偏离原始焦平面。如果您的显微镜不具备电动调焦功能，可手动调节焦距，以追踪您感兴趣的细胞或结构。
  9. 输入所需的时间点数量和时间间隔。我们通常使用15秒的时间间隔，并设置最多500个时间点。我们一般会预设比实际需要更多的时间点，并在达到所需数据时停止采集。如果需要对多个焦平面进行成像，请确保在相邻时间点之间的时间间隔内有足够的时间完成所有焦平面的采集。
  10. 选择或创建一个位置以保存数据。确保软件设置为仅显示最新图像。为文件命名，然后点击“Acquire”（采集）。在开始的几个时间点，监控自动图像采集过程，以确保其正常运行。
  11. 当您希望停止采集时，点击停止，切换到10倍物镜，并准备下一个载玻片。
  12. 成像完成后，从光路中移除DIC组件。如有必要，清洁物镜上的油渍。从相机开始，依次关闭所有设备。

GFP 动态图像

  1. 启动显微镜并如上所述找到胚胎。使用包含荧光快门软件控制的配置文件。
  2. 确保上方微分干涉差（DIC）棱镜（滑块）不在光路中。
  3. 将滤光立方切换至 FITC/GFP（启动时自动设置）。
  4. 将相机增益调整为 255，图像文件格式设为 16 位 Tiff（使用此配置文件时启动时自动设置）。
  5. 关闭白光光源。
  6. 点击“实时成像”以预览图像。操作应迅速，以尽量减少光照暴露。也可使用“单帧拍摄”采集单幅图像。
  7. 调节汞灯功率/中性密度滤光片和曝光时间以获得良好的图像。通常应使用最低限度的光照到达样品，以获取所需数据，同时减少对细胞的光损伤以及荧光信号的光漂白。
  8. 设置时间间隔、时间点数量和焦平面数量。我们通常使用 5-10 秒的时间间隔和 1-3 个焦平面。
  9. 选择感兴趣区域（ROI），并按照步骤 13-19 中所述设置图像采集参数。

分析电影

  1. 数据将保存到您输入名称的文件夹中，包含4D图像序列中每幅图像对应的系列tiff文件、一个文本文件和一个xml文件，其中包含曝光水平和时间间隔等元数据。
  2. Tiff 图像可通过两种方法在 ImageJ 中打开。第一种（方法 a）最为简单，且可读取每个文件的元数据。第二种（方法 b）能够利用虚拟内存打开超出 ImageJ 分配内存容量的文件，但不包含元数据。
    1. 使用 Micro-Manager 插件
      1. Micro-Manager 基于 ImageJ 构建并使用 ImageJ（它将安装一个新版本的 ImageJ，该版本将不同于您之前可能已安装的任何其他版本），并包含一个用于打开数据的插件。或者，您可以将 Micro-Manager-1.3/plugins 文件夹中的内容复制到其他版本 ImageJ 的 plugins 文件夹中。
      2. 转到插件菜单，选择 Micro-Manager，然后打开 Micro-Manager 文件。
      3. 选择包含您希望查看数据的文件夹，然后单击“确定”。
      4. 在Z轴和T轴维度中播放。
    2. 使用 LOCI 插件通过 BioFormats 导入器打开视频文件。
      1. 将 xml 和 txt 文件从包含 tiff 文件的文件夹中转移，并将这两个文件重命名为与数据集相同的名称。
      2. 在 ImageJ 中，进入插件下拉菜单，选择 LOCI，然后选择数据浏览器或 Bio-Formats 导入器。
      3. 找到包含您 tiff 图像序列的文件夹。单击第一个 tiff 文件，然后打开。
      4. 使用 Hyperstack 查看堆栈。在“数据集组织”中：选择“以相似名称分组文件”，交换维度并打开所有序列。在“内存管理”中：选择“使用虚拟堆栈”（尤其适用于大型数据集）。点击确定
      5. 该插件将确定数据集的维度（时间点数量和焦平面数量），并显示一组之间的范围 <> 括号。单击“确定”或修改时间点和/或焦平面的数量以打开。
      6. 确认每个序列对应的维度。
      7. 在Z轴和T轴维度上播放。

代表性结果

细胞分裂的延时显微观察；连续图像显示有丝分裂进程。
图1. Nomarski微分干涉差（DIC）录像中的静态图像，展示了早期C. elegans胚胎发育过程中的正常细胞事件：原核迁移（0-5:45）、不对称的第一次分裂（6:45-14:45）以及不同步的第二次分裂（14:45-27:00）。数据使用60倍、数值孔径1.35的物镜采集，每15秒采集一次、每次曝光40 μs，共采集20个焦平面，层厚间隔为1微米。图像已旋转，使后端位于右侧，腹侧位于下方。比例尺代表10微米。

细胞有丝分裂的延时显微成像，六个阶段，细胞分裂过程，生物学成像。
图2. 荧光动态成像的静态帧，展示了染色体乘客复合物（AIR-2）的一个GFP标记亚基在染色体上的动态运动过程：从中期到早后期（A至C），随后出现在后期纺锤体中区，直至胞质分裂完成（C至F）。数据使用60倍、1.35 NA的物镜采集，每10秒获取一个焦平面，曝光时间为50 μsec。图像已旋转，使后端位于右侧。比例尺代表10微米。

视频 1 野生型胚胎的诺马尔斯基显微视频。
对应于图1的视频。后端位于右下角，腹侧位于左下角。显示原始数据集的单个焦平面。图像每15秒采集一次，回放速度设置为每秒14帧。点击此处观看视频

影片 2 表达 GFP::AIR-2 的野生型胚胎的荧光成像。
该影片对应于图 2。后端朝向右上方。影片以单焦平面采集，每 10 秒获取一次图像，播放速度设置为每秒 14 帧。点击此处观看视频

讨论

活细胞延时成像的一个主要考虑因素是保持细胞和生物体的完整性和活力。微分干涉差（DIC）显微镜的优势在于样品不会暴露于紫外光下，也避免了光源带来的过度加热。DIC显微镜非常适合检测细胞迁移和细胞形态变化（如胞质分裂），并可用于识别某些亚细胞结构，例如有丝分裂纺锤体和核膜。报告蛋白的荧光成像可补充DIC显微镜的不足，能够标识更多的亚细胞区域，并实现对特定蛋白质的可视化。为了减轻荧光成像过程中光毒性对胚胎造成的损伤，我们通常会提高相机的数字增益，以补偿降低的紫外光强度和缩短的照明时间。对于荧光信号较弱的转基因报告蛋白，可采用去卷积算法重新分配离焦光线，或使用去模糊算法降低背景噪声，从而提高所捕获图像的质量。尽管在某些情况下需要使用共聚焦或双光子显微镜等先进设备，但我们发现许多荧光报告蛋白均可通过这种落射荧光显微镜系统进行成像，并获得高质量图像。

Micro-Manager（http://www.micro-manager.org）除了免费之外，还能将文件直接保存为TIFF格式，而不是许多商业软件包的专有文件格式。这显著简化了我们的数据分析过程，因为在使用ImageJ、Photoshop及其他图像编辑软件读取图像文件时，无需再进行文件格式转换。

致谢

本研究得到了密歇根大学内部机构资金和生物科学学者计划的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
配备 Hamamatsu Orca-ER 相机的 Olympus BX61 显微镜。10x Plan Fluorite（NA 0.3）和 60x PlanAchromat（NA 1.35）物镜Olympus Corporation
Micro-Manager 1.3.46Micro-Managerhttp://www.micro-manager.org
Image J 1.43http://rsbweb.nih.gov/ij
loci_tools.jarhttp://www.loci.wisc.edu
琼脂糖 — 分子生物学/凝胶电泳级
Fisher Superfrost/Plus 显微镜载玻片Fisher Scientific12-550-15
实验室胶带Fisher Scientific15-901
18 mm × 18 mm #1.5 盖玻片
M9（242 mM KH2PO4，40 mM Na2HPO4，9 mM g NaCl，19 mM NH4Cl MgSO4）
（http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm）。
卵缓冲液（118 mM NaCl，48 mM KCl，2 mM CaCl2，2 mM MgCl2，25 mM HEPES，pH 7.3）25。
凡士林
刷子/细棒
剃须刀片
加热块
解剖显微镜
线虫22
铂金丝挑针22
27G1/2 Precision Glide 针头或带小刀片的手术刀BD Biosciences

参考文献

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