研究昆虫适应性运动行为的神经基础

摘要

我们描述了一种方法，可记录在光滑表面上行走的固定昆虫的运动活动，并将其与电记录的跗节接触信号进行时间同步。该方法用于研究在减少腿部通过基质产生机械相互作用影响的条件下，适应性行为的神经基础。

摘要

研究行走行为的神经基础时，人们常常面临一个问题：难以将神经活动产生的步态输出与由被动力以及通过共同接触基质与其他腿相互作用而引起的腿部运动区分开来。如果我们希望了解某一特定运动中哪些部分是由神经系统运动输出产生的，那么步态运动的运动学分析就需要辅以运动活动的电生理记录。在行为动物中记录神经或肌肉活动通常受到电生理设备的限制，这些设备可能会约束动物的自由活动能力，使其无法以尽可能多的自由度进行运动。这一问题可以通过使用可植入电极并让动物在长系线状态下活动（例如 Clarac et al., 1987；Duch & Pflüger, 1995；Böhm et al., 1997；Gruhn & Rathmayer, 2002）来避免，或者通过遥测装置传输数据来解决（Kutsch et al, 1993；Fischer et al., 1996；Tsuchida et al. 2004；Hama et al., 2007；Wang et al., 2008）。这两种精巧的方法虽已在较大的节肢动物中成功应用，但在体型较小的行走昆虫中往往难以实施，因为这些昆虫容易被长系线缠住，或因遥测设备及其电池的重量而行动受阻。此外，在所有上述情况下，仍然无法区分运动的纯粹神经基础与行走腿通过基质产生的机械耦合效应。解决该问题的一种方法是，在一个被固定但可原地自由行走且局部悬浮（例如悬浮于光滑表面之上）的动物上进行实验，从而有效消除大部分地面接触力学的影响。这种方法已被用于研究逃避反应（Camhi 和 Nolen, 1981；Camhi 和 Levy, 1988）、转向行为（Tryba 和 Ritzman, 2000a,b；Gruhn et al., 2009a）、倒退行走（Graham 和 Epstein, 1985）或速度变化（Gruhn et al., 2009b），并使实验者能够轻松地将细胞内和细胞外生理记录与运动学分析相结合（Gruhn et al., 2006）。

我们采用一种光滑表面装置，研究完整和简化 preparations 中的竹节虫在不同行为范式（如直线行走和曲线行走）下，腿部肌肉活动时机相对于触地和离地时刻的关系。

方案

1. 行走表面

黑色行走表面由两块镀镍黄铜板组成，这两块板永久性地并排连接，沿动物纵轴正下方通过一条宽2 mm的双组分环氧胶（UHU plus，UHU GmbH，德国）彼此电绝缘。它们形成的总表面积为13.5×15.5 cm（图1）。左右腿半平面的分离设计可实现对每侧单个腿的跗节接触独立监测。

1. 用甘油与水的混合物润滑载物台，混合比例为95份甘油与5份饱和NaCl溶液，以提供润滑性及电导性；其黏度约为430cStokes（Shankar和Kumar，1994）。
2. 将该混合物直接涂布于表面，并用一片软纸巾均匀铺展，确保整体厚度为0.1–0.2 mm。

2. 光学刺激装置

1. 使用两个投影仪按照 Scharstein (1989) 所述方法，在两个圆形磨砂玻璃屏幕（直径 130mm，Marata 屏幕，Linos Photonics，Göttingen，德国）上投射条纹图案，以诱发行走行为。这两个屏幕位于动物眼睛前方约 70mm 处，分别置于平台左前侧和右前侧，呈 45° 角（图1）。条纹图案的波长保持恒定，λ=21°。移动刺激的对比频率可在 0.35、0.72、1.07 和 1.49 Hz 之间调节。由于当图案对比度足够高时，动物的反应仅取决于对比频率 ω/λ（ω = 角速度，λ = 图案波长）（Fermi 和 Reichhardt，1963），因此在整个实验过程中我们未改变 λ。动物一侧亮条纹的亮度约为 15cd/m²，对比度为 0.8。竹节虫（Carausius morosus）的复眼在背腹轴上有 24 个小眼面（Friza，1928），在头尾轴上略多一些。由于竹节虫复眼的平均发散角为 6.2°（Jander 和 Volk-Henrichs，1970），因此我们的图案波长约为小眼面夹角的 4 倍。实验在暗室内的屏蔽室（Faraday cage）中进行，环境温度保持在 20–22°C。
2. 通过在两个屏幕上呈现向前移动的图案（即每个屏幕上的条纹向外移动），或在两屏幕之间放置一条位于白色背景上的单个黑色光束，可诱发动物向前行走。
3. 当两个屏幕上的条纹朝相同方向移动时，可诱发动物转向行为。我们未发现移动条纹的速度与转角大小之间存在相关性。一旦设定条纹图案的亮度以诱发行走行为，通常无需进一步调整；但可根据不同动物的需求，通过调节投影仪中卤素灯的电压来调整亮度。

3. 实验动物的准备

1. 将雌性成年竹节虫（Carausius morosus）腹侧朝下用牙科水泥（ProTempII, 3M ESPE, Seefeld, Germany）粘附于一根薄的轻木棒（3x5x100 mm，宽×高×长）上，该木棒插入带有多个连接器的黄铜管中。将动物固定约一分钟，直至胶水至少部分固化。
2. 昆虫的头部和足部从前部和侧面伸出，以保证其可自由活动。所有足的基节区域以及腹部的大部分区域必须保持未被胶水覆盖。
3. 用荧光颜料（Dr. Kremer Farbmühle, Aichstetten, Germany）与牙科水泥混合后标记昆虫的头部、胸部以及每条股节和胫节的远端，以便后续视频追踪。

4. 肌电图电极的放置

通过植入胸部的肌电图（EMG）电极记录不同腿部肌肉的肌肉活动，例如本示例中的髋节前伸肌和后缩肌。这些肌肉位于胸部，分别引起腿部的前伸（向前运动）和后缩（向后运动）。所有肌电图记录均采用差分放大。信号首先在前置放大器（科隆大学动物学研究所电子车间）中放大100倍，经过带通滤波（100 Hz–2000 Hz），再进一步放大10倍，随后通过模数转换器导入spike2软件（Vers.5.05，CED，英国剑桥）进行分析。

1. 电极由涂覆铜线制成（Elektrisola，Eckernhagen，德国；外径47μm）。制作一个电极时，先将两根导线涂上胶水，然后将两根粘性导线相互绞合。
2. 将绞合导线的一端焊接到迷你插头上；另一端则剪断，以获得无绝缘层的清洁端部，便于插入动物体内。
3. 肌电图电极插入黄铜管末端的小型连接器中。
4. 使用一枚微小的固定针在体壁上穿刺出小孔。
5. 随后将电极的剪断端分开，并插入肌肉中，彼此间距约为1 mm，根据我们的经验，此距离可获得良好的信噪比。应注意避免将电极插入过深，以防损伤肌肉。图2显示了电极在动物胸部的位置。图3显示了已安置好电极导线的动物。
6. 我们使用少量组织丙烯酸胶（3M Vetbond，St. Paul，MN，美国）固定导线位置。
7. 将一根接地导线插入腹部。

5. 足跗节接触的记录

跗节接触始终与肌电图（EMG）记录同步进行。由于光滑表面被分为两个半区，因此同一时间最多可记录两个对侧的跗节接触。实验中，将昆虫的腿作为“开关”，用于闭合平板与放大器之间的电路。通过位于每个平板底部的两个插座，可分别为两块平板施加电流。我们使用脉冲发生器（型号 MS501，科隆动物研究所电子车间）产生两个振幅为 2–4 mV 的方波信号，二者相位相差 90°。这些信号经 60 dB（/1000）衰减后，分别施加到光滑表面的两个半区。本实验中仅使用两个信号中的一个，该信号同时作为参考信号输入至锁相放大器。双相位锁相放大器（科隆动物研究所电子车间）仅对与参考信号频率和相位相同的信号进行选择性放大，第二通道则仅检测相位延迟 90° 的信号。频率不同于参考信号的噪声信号将被抑制，不会影响测量结果。放大器输出信号被输入模数转换器（Micro 1401k II，CED，英国剑桥）并通过 Spike2 软件进行数字化处理。当跗节接触并离开光滑表面时，电流从平板经跗节和胫节流向铜导线（见下文：5.3–5.8）。所选用的放大器具有高输入阻抗（1 MΩ），且信号电压非常微弱，以避免干扰动物的行走行为。流经跗节和胫节的电流在 2 至 4 nA 之间。在跗节接触瞬间，从进入润滑剂到与表面实际接触之间的信号响应时间小于 1 ms。而在离面阶段，接触信号的变化斜率较缓且存在延迟，这是由于毛细上升效应导致润滑剂从跗节上撕裂的过程延迟，以及摆动相中腿部运动未完全离面所致。

1. 将粘有动物的轻木棒插入黄铜管，并将黄铜管固定于显微操作器上，以调节动物高度，使其位于防滑表面以上7至12 mm处，该高度相当于动物自由行走时的高度。
2. 为了在监测腿的昆虫跗节接触地面时测量电流，将直径为47μm的导线剪成约15 cm长的小段。
3. 通过酒精燃烧去除铜线表面的绝缘层。
4. 将导线一端弯成环状，并套入动物的跗节。
5. 将导线环在胫节远端打结固定，以确保动物与导线之间保持良好接触。
6. 随后使用一滴双组分胶（ProTempII，见上文）将导线固定在动物胸部，并通过鳄鱼夹连接至差分放大器。
7. 为提高导线末端的导电性，在接触区域涂抹一滴电极膏（Marquette Hellige，德国弗赖堡）。
8. 然后在显示器上测试信号强度。由于锁相放大器具有低通滤波特性（时间常数为10 ms），且跗节的抬起和着地过程较为平缓，因此信号并非精确的方波信号。因此，必须在接近转换点的位置设置合适的阈值，以确定跗节接触的精确时间，并由人工逐个检查数字化软件所判定的每个事件。根据跗节接触情况，我们将某一特定腿的跗节接触地面的时间定义为支撑相，悬空的时间定义为摆动相。
9. 摄像机的触发信号与肌电图（EMG）轨迹及跗节接触信号同步记录，从而实现行为与记录轨迹之间精确的逐帧对应。

6. 腿部运动的光学记录用于数字分析

竹节虫在光滑表面上的步频可达 3-4Hz（Graham 和 Cruse，1981）。

1. 在记录行走序列之前，在动物后方以45°角放置一面镜子，以便额外目视监测触地情况。相机通过外部触发，图像经由FireWire接口传入计算机。
2. 我们使用高速摄像机（Marlin F-033C，Allied Vision Technologies，Stadtroda，德国）从上方以100fps的帧率记录行走序列，以对腿部运动进行数字化分析，并将其与肌电活动及跗节接触情况进行关联。
3. 在记录行走序列期间，使用蓝色LED阵列（30-50V DC，亮度24cd，科隆大学动物学研究所电子工坊）对动物进行照明，调节光照强度以充分激发荧光标记物。根据文献记载（Schlegtendal, 1934），竹节虫不具备色觉，且我们未观察到紫外光照明对其转向反应产生不利影响。在相机镜头前加装黄色滤光片，可抑制激发光的短波成分，从而提高视频记录的对比度。
4. 视频文件可使用运动追踪软件（WINanalyze，版本1.9，Mikromak service，柏林，德国）进行分析。

7. 行走序列的记录

1. 作为对照，首先记录完整动物的行走序列。
2. 设定条纹图案的移动速度，并几乎同时启动图案运动和视频记录。
3. 如果动物未自发启动运动，可通过毛刷刺激其腹部（Bässler and Wegener, 1983），或向触角吹气进行刺激。此时，若动物腹部左侧被触碰，则倾向于向左转，反之亦然。条纹图案持续移动，直至动物停止行走，或连续记录达3分钟为止。
4. 为了检验某一条腿的肌肉活动在多大程度上依赖于邻近腿的感官输入，需诱导动物自切其腿。自切部位可在数秒内自然闭合。图3展示了一只前腿和后腿均已自切动物的示例。
5. 例如，在仅保留中足的动物实验中，我们通过镊子夹压近端股节（Schmidt and Grund, 2003）诱导前胸和后胸足的自切，或在记录完整动物数据后，在基节水平切断腿部。此后，给予动物至少30分钟的恢复时间。
6. 然后，我们按前述方法记录新的行走序列。在去肢处理后的准备标本中，常需使用画笔轻刷来诱导行走。

8. 代表性结果：

图1. 实验装置；A：一只被固定在光滑表面之上的竹节虫照片，其腿部标记有荧光色素用于运动追踪，并连接导线用于肌电记录和跗节接触测量。B：在光滑表面上行走时双侧腿部跗节接触记录的接线示意图。

图2. 在竹节虫中足胸部的伸肌和缩肌中放置肌电图电极的位置。ML：中足；FL：前足

图 3. 中间腿的前伸肌和后缩肌中已插入肌电电极的竹节虫；为研究相邻腿部存在对简化制备标本中中间腿运动学及肌肉活动的影响，前腿和后腿已被移除。

图 4. 转弯过程中内侧中足腿回缩肌肌电活动的示例轨迹，参考信号为跗节接触状态。轨迹起始阶段（第一个蓝色框）显示，回缩肌在支撑相期间活跃，同时腿部与地面接触（“闭合电路”），表明腿部正在进行向前迈步；经过短暂切换后（第二个蓝色框），回缩肌在摆动相期间活跃，而腿部处于悬空状态（“开路”，第三个蓝色框），表明此时出现向后迈步。

图 5. 腿节肌（上迹线）和缩肌（中迹线）的肌电图记录，以及同步记录的跗节接触信号（下迹线）的截图。注意肌电图迹线中交替出现的活动，这对应于步态周期中两块肌肉的活动：即在摆动相之前及期间出现腿节肌活动，此时跗节接触迹线显示与地面失去接触；而在跗节触地之后及期间出现缩肌活动，此时肢体处于支撑相。插图显示了与此记录相对应的匹配视频文件，用于验证动物的行为。

讨论

我们描述了一种实验装置，该装置能够通过光学诱导产生转向行为，并在很大程度上将神经源性的行走活动与因其他行走肢在地面上机械位移所导致的被动效应解耦。另一方面，腿之间通过神经系统传递关于地面反作用力或跗节接触信息的可能性仍然存在，这使得研究者能够在简化制备条件下研究此类信息的影响。该装置使用光滑表面的主要优势在于，动物表现出极强的行走倾向；与在转轮上行走或踏步不同，动物可以在自然行走的所有方向上完成摆动相和支撑相的运动。此外，所有肢体的自由度使动物能够执行曲线行走，无论其为完整制备还是半完整制备。由于肢体不能仅通过动物的前向运动或其下方基底的移动而被被动带动，因此每一个动作都真实反映了该肢体的运动输出（Cruse, 1976；Graham and Wendler, 1981）。该装置非常适合用于研究适应性行为（如转向、前进与后退行走）的神经基础，因为可以将运动活动的电生理记录与肢体运动学分析相结合。

我们利用竹节虫的视动反应来诱发其行走。动物对旋转条纹图案的反应表明，它们在光滑表面上被固定时，仍具备执行转弯行走的准备状态。最让我们感到意外的是，单腿 preparations 中的单个腿所表现出的运动模式在定性上与完整动物中的表现相同。因此，我们有理由相信，转弯行走的控制在很大程度上可以不依赖来自相邻腿的协调感觉输入而实现。在后续实验中，检验被移除腿的运动神经元活动是否也受到视动图案的影响将十分重要。该实验装置可轻松改造，用于研究其他行为任务，例如通过在动物前方放置单一条纹或轻拉触角来研究直线前进或后退行走。

精确测量足部与地面的接触，使我们能够关联肌肉活动与腿部位置。这种电信号接触的时间分辨率高于1毫秒，使我们对摆动相向支撑相转换的时机有了新的认识。由于导电润滑剂剪切存在延迟，以及在光滑表面上前移时无需完全抬离，支撑相向摆动相转换的分辨率较差。然而，精确掌握摆动相向支撑相的转换，是理解不同行为背景下控制肌肉时序及腿部肌肉协调活动机制的尤为有用的首要步骤（另见：Büschges et al., 2008；Büschges & Gruhn 2008）。

例如，我们使用了中足的收肌（retractor）和伸肌（protractor）肌肉，并将其活动精确地与步态从摆动相向支撑相的转换相对应，同时持续监测该足所处的行为背景。为此，我们诱导昆虫行走并连续记录肌肉活动。根据转向方向的不同，某一条足可以作为内侧足或外侧足。在作为功能意义上的内侧足的行走中足中，可以观察到收肌和伸肌均可作为功能性的支撑相肌肉发挥作用，因为该足除了产生向前的步态外，还会间歇性地产生向后的步态（见图4）。

来自两块肌肉的肌电图（EMG）信号经过整流后，以触地时刻为基准进行归一化处理，并计算了第一波肌电尖峰的潜伏期。有趣的是，这两块肌肉的潜伏期相对于抬足和触地的时间依赖于肌肉的功能——即作为摆动相或支撑相肌肉（见图4），而非取决于肌肉本身，且其活动起始时间仅有轻微变化。大多数关于从摆动相转为支撑相状态转换的解释均假设，跗节接触的感官信号会触发支撑相的开始。现在，借助改进后的实验装置，可以进一步探究竹节虫在触地与肌肉激活之间为何存在如此短的潜伏期，以及这一过程依赖于哪些感官信息。

综上所述，我们展示了一种光滑表面装置，可稳定地诱发静止状态下的竹节虫进行直线和曲线行走。可在两种不同的行为背景下同时监测并关联运动学、肌肉活动以及跗节触地与离地的时间。这为我们提供了极佳的工具，用以研究单条腿乃至完整动物个体中肌肉活动与行为背景之间的详细关联及其潜在机制。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
双组分环氧胶	UHU plus, UHU GmbH, 德国
玻璃屏（直径130 mm）	Linos Photonics
牙科水泥	ProTemp II, 3M ESPE, Seefeld, 德国	3M 编号：70-2011-0358-0，目录编号：46430	可通过 3M（http://www.3m.com/）或牙科供应商获取
荧光颜料	Dr. Kremer Farbmühle, Aichstetten, 德国	目录编号：例如 56200 荧光颜料金黄色、56350 荧光颜料火焰红色	http://kremer-pigmente.de/en 或 http://www.kremerpigments.com/
组织用丙烯酸胶	3M		供应商：WPI
包覆铜线	Elektrisola Eckernhagen		http://www.elektrisola.com/
电极膏	Marquette Hellige, Freiburg, 德国		该产品现已停产，我们建议例如：www.grasstechnologies.com
脉冲发生器	型号 MS501，电子车间，动物学研究所，科隆，德国
锁相放大器	动物学研究所
模数转换器	Cambridge Electronic Design
前置放大器	动物学研究所
高速摄像机	Allied Vision Technologies
紫外LED阵列	动物学研究所		30–50 V 直流，电子车间 λ390–395 nm 亮度 24 cd
数字化软件 Spike2	版本 5.05, CED, 剑桥, 英国
运动追踪软件	Mikromak service, 柏林, 德国	WINanalyze, 版本 1.9