传代人类神经干细胞

Summary

操作能力在体外培养人类神经干/前体细胞（hNSPCs）允许调查作为细胞移植用于治疗目的的实用价值与探索人类的神经系统发育。该协议提出希望增加人类干细胞研究的可重复性的培养和传代hNSPCs的方法。

Abstract

操作能力在体外培养人类神经干/前体细胞（hNSPCs）提供了一种手段调查细胞移植用于治疗目的的效用，以及探索人类神经系统发育和病理的许多基本过程。该协议提出了希望规范这种技术和提高人类干细胞研究的可重复性的一个简单的方法，培养和传代hNSPCs。我们使用的hNSPCs尸体产后大脑皮质中分离，由国家人类神经干细胞资源，并成长为烧瓶壁的文化与纤维连接蛋白（Palmer等人，2001年。Schwartz等人，2003年）涂层。我们的文化我们hNSPCs DMEM培养液:无血清F12媒体补充EGF，FGF和PDGF，通过他们的1:2，大约每7天。利用这些条件下，广大文化细胞保持双极形态和未分化的神经干细胞（如nestin和SOX2）表达的标记。

Protocol

注意 :对于我们hNSPCs的日常培养，我们改变了50-100％的媒体隔日通常通过他们1:2每周一次。文化传媒，包含20％位9500 1X抗生素/ antimycotic，和生长因子（EGF，FGF和PDGF在40毫微克/毫升）的DMEM:F12基地媒体。

准备涂层烧瓶中，游离的细胞

1. 为了准备新的传代细胞，大衣10微克/毫升EMEM人纤维连接蛋白为4小时，或隔夜与T25烧瓶，在37 ° C间组织培养箱内培养烧瓶。前传代细胞，去除纤维连接蛋白的解决方案，并用PBS冲洗烧瓶。
2. 从细胞传代，以新的纤维连接蛋白涂层烧瓶（如最终成交量的一半，每个烧瓶媒体将"空调"的媒体），转移旧的"空调"的媒体。这些培养条件，帮助保持这些细胞的未分化状态。
3. 一旦所有的媒体都从传代的细胞取出，冲洗细胞一次，用PBS。小心不要干细胞。
4. 直接加入到细胞为T25烧瓶（1.0-1.5毫升）细胞解离缓冲器（CDB）。在缓冲区中孵育细胞在室温下约5分钟。轻轻拍打烧瓶中，将有助于加快细胞脱落。

离心，Resuspending，电镀细胞

1. 烧瓶与分离的细胞中加入含血清的介质（DMEM:F12与10％热灭活胎牛血清）（使用〜3倍量的国家开发银行）。删除到15毫升锥形管媒体和细胞。体积小，使用新鲜的含血清媒体冲洗烧瓶，并收回剩余的细胞。

Discussion

我们发现，这个协议提供了可靠的文化hNSPCs。我们的细胞的一个关键因素是，他们需要保持相当密集的文化，不能传代细胞稀疏的点。在我们手中，稀疏的文化成长非常缓慢或完全停止分裂。出于这个原因，我们通常会分裂我们的文化为1:2或1:3时，文化是非常密集。涂层与纤维连接蛋白的培养皿的表面是很重要的，因为它可以促进良好的细胞粘附和迁移，但与层粘连蛋白，它也允许使用细胞解离缓冲器（CDB）来分离细胞。层粘连蛋白是细胞附着太强大了，需要使用的一种蛋白水解酶（如胰蛋白酶），细胞脱落。非酶CDB是首选胰蛋白酶，因为细胞表面蛋白水解裂解可能导致形态的变化，随着时间的推移在hNSPCs。此外，在条件培养基培养hNSCPs有助于维持这些细胞的未分化状态。

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Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BIT-9500 （BSA， Insulin， Transferrin）	试剂	Stem Cell Technologies	09500
抗生素-抗真菌试剂		Invitrogen	15240-062
DMEM：F12 （1X）	试剂	Invitrogen	11330-032
EMEM （1X）	试剂	Mediatech， Inc.	MT-10-010-CV	由 Fisher 在指定目录下分发 #
胎牛血清	试剂	Invitrogen	10437-028
FGF，人碱性重组	试剂	PeproTech Inc	100-18B
PDGF-AB	试剂	PeproTech Inc	100-00AB
EGF，人重组	试剂	BD Biosciences CB40052		由 Fisher 在指定目录下分销 #
Cell Culture Flask， 25 cm2	Tool	Corning	10-126-28	由 Fisher 在指定目录下分销 #
纤连蛋白，人类，天然	试剂	BD Biosciences CB40008A		由 Fisher 在指定目录下分销 #
人类神经干细胞/前体细胞		国家人类神经干细胞资源
细胞解离缓冲液	试剂	Invitrogen	13150-016