在体外操控人神经干细胞/前体细胞（hNSPCs）的能力，使得研究人员能够探索其作为细胞移植用于治疗目的的潜力，并研究人类神经系统的发育过程。本方案介绍了一种培养和传代hNSPCs的方法，旨在提高人类干细胞研究的可重复性。
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摘要
摘要
体外操控人神经干细胞/前体细胞（hNSPCs）的能力为研究其作为细胞移植治疗手段的潜力提供了途径，同时也可用于探索人类神经发育及病理过程中的诸多基本机制。本方案介绍了一种培养和传代hNSPCs的简便方法，旨在标准化该技术，提高人类干细胞研究的可重复性。我们所使用的hNSPCs由国家人类神经干细胞资源中心（National Human Neural Stem Cell Resource）自死后婴儿脑皮层中分离获得，并在经纤维连接蛋白（fibronectin）包被的培养瓶中以贴壁培养方式生长（Palmer et al., 2001；Schwartz et al., 2003）。我们将hNSPCs培养于添加了EGF、FGF和PDGF的DMEM:F12无血清培养基中，约每七天以1:2比例进行传代。在这些培养条件下，培养物中的大多数细胞保持双极形态，并表达未分化神经干细胞的标志物（如nestin和sox2）。
方案
注意：对于我们的hNSPCs常规培养，我们每隔一天更换50-100%的培养基，通常每周以1:2的比例传代一次。培养基由DMEM:F12基础培养基添加20% BIT-9500、1X 抗生素/抗真菌剂以及生长因子（EGF、FGF和PDGF，每种均为40 ng/mL）组成。
准备包被培养瓶并解离细胞
- 为准备用于传代细胞的新培养瓶，用含10 µg/ml人纤维连接蛋白的EMEM在37°C组织培养孵箱中对T25培养瓶进行包被，孵育4小时或过夜。在细胞传代前，移除纤维连接蛋白溶液，并用PBS冲洗培养瓶。
- 将待传代细胞的旧“条件培养基”转移至新的纤维连接蛋白包被的培养瓶中（使每瓶最终培养基体积的一半为“条件培养基”）。此类培养条件有助于维持细胞的未分化状态。
- 从待传代细胞中完全移除培养基后，用PBS轻轻冲洗细胞一次。注意避免细胞干燥。
- 直接将细胞解离缓冲液（CDB）加入细胞中（T25培养瓶加1.0–1.5 ml）。室温下孵育约5分钟。轻轻敲击培养瓶有助于加快细胞脱落。
离心、重悬和接种细胞
- 向含有已脱落细胞的培养瓶中加入含血清的培养基（DMEM:F12 加 10% 热灭活胎牛血清）（体积约为 CDB 的 3 倍）。将培养基和细胞转移至 15 ml 圆底离心管中。用少量新鲜含血清培养基冲洗培养瓶，以回收残留细胞。
- 以 1000 rpm（约 200×g）离心 5 分钟。
- 吸除含血清的培养基，将细胞重悬于新鲜培养基中，反复吹打以形成均一的细胞悬液。
- 将重悬后的细胞平均分成两份 ，分别接种至两个新培养瓶中，进行 1:2 传代。在培养瓶上标注新的传代次数。
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讨论
我们发现该方案能够获得可靠的hNSPCs培养物。影响细胞生长的一个关键因素是，细胞必须保持较高的密度培养，不能传代至细胞过于稀疏的状态。在我们的实验中，稀疏的培养物生长极为缓慢，甚至完全停止分裂。因此，当培养物密度极高时，我们通常以1:2或1:3的比例进行传代。使用纤连蛋白（fibronectin）包被培养皿表面非常重要，因为它能促进细胞的良好贴附和迁移；同时，与层粘连蛋白（laminin）不同，它允许使用细胞解离缓冲液（Cell Dissociation Buffer, CDB）来解离细胞。细胞在层粘连蛋白上的贴附过于牢固，必须使用蛋白水解酶（如胰蛋白酶）才能实现细胞解离。相比胰蛋白酶，我们更倾向于使用非酶性的CDB，因为蛋白酶对细胞表面蛋白的切割可能随时间推移导致hNSPCs发生形态学改变。此外，使用条件培养基培养hNSPCs有助于维持其未分化状态。
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致谢
作者们衷心感谢橙县儿童医院研究学院国家人类神经干细胞资源中心的 Philip H. Schwartz 博士，感谢他提供了人神经干细胞前体细胞（hNSPCs）以及有关其培养的初步指导。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| BIT-9500（BSA、胰岛素、转铁蛋白） | 试剂 | Stem Cell Technologies | 09500 | |
| 抗生素-抗真菌剂 | 试剂 | Invitrogen | 15240-062 | |
| DMEM:F12 (1X) | 试剂 | Invitrogen | 11330-032 | |
| EMEM (1X) | 试剂 | Mediatech, Inc. | MT-10-010-CV | 由 Fisher 以所示目录编号经销 |
| 胎牛血清 | 试剂 | Invitrogen | 10437-028 | |
| FGF，人源碱性重组蛋白 | 试剂 | PeproTech Inc | 100-18B | |
| PDGF-AB | 试剂 | PeproTech Inc | 100-00AB | |
| EGF，人源重组蛋白 | 试剂 | BD Biosciences | CB40052 | 由 Fisher 以所示目录编号经销 |
| 细胞培养瓶，25 cm² | 工具 | Corning | 10-126-28 | 由 Fisher 以所示目录编号经销 |
| 纤维连接蛋白，人源天然蛋白 | 试剂 | BD Biosciences | CB40008A | 由 Fisher 以所示目录编号经销 |
| 人神经干细胞/前体细胞 | 细胞 | 国家人神经干细胞资源中心 | ||
| 细胞解离缓冲液 | 试剂 | Invitrogen | 13150-016 |
参考文献
- Flanagan, L. A., Rebaza, L. M., Derzic, S., Schwartz, P. H., Monuki, E. S. Regulation of human neural precursor cells by laminin and integrins. J. Neurosci. Res. 83, 845-856 (2006).
- Nethercott, H. N., Maxwell, H., Schwartz, P. H. Neural stem cell culture. Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide. Loring, J. F., Wesselschmidt, R. W., Schwartz, P. H. , Elsevier/Cell Press. (2007).
- Palmer, T. D., Schwartz, P. H., Taupin, P., Kaspar, B., Stein, S. A., Gage, F. H. Cell culture. Progenitor cells from human brain after death. Nature. 411, 42-43 (2001).
- Schwartz, P. H., Bryant, P. J., Fuja, T. J., Su, H., O'Dowd, D. K., Klassen, H. Isolation and characterization of neural progenitor cells from post-mortem human cortex. J Neurosci Res. 74, 838-851 (2003).
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