本文介绍了一种使用 Invitrogen 公司提供的商品化 NuPAGE 电泳 Mini-Gel 系统进行标准蛋白质印迹（Western blotting）的实验方法。
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本文内容
摘要
摘要
蛋白质印迹（或称免疫印迹）是一种标准的实验室技术，可使研究人员验证蛋白质的表达，确定不同样品中该蛋白质的相对含量，并分析共免疫沉淀实验的结果。该方法通过特异性的一抗在特定组织匀浆或提取物样品中检测目标蛋白。利用变性的SDS-PAGE按分子量大小分离蛋白质。在将蛋白质转移至膜上后，用特异性一抗孵育以识别目标蛋白，并通过化学发光法进行检测。
自首次描述以来，蛋白质印迹技术已历经多次改进，包括预制胶和用户友好的设备。在本实验室中，我们选择使用 Invitrogen 公司提供的商业化 NuPAGE 电泳系统。该系统是一种创新的中性 pH 值、不连续 SDS-PAGE 预制小型凝胶系统。与传统的 Laemmli 技术相比，该系统具有多项优势：i）预制胶保质期更长，可达 8 个月至 1 年；ii）根据所用凝胶类型的不同，分子量分离范围更广，可覆盖 1 至 400 kDa；iii）更高的灵活性（包括丙烯酰胺百分比范围、凝胶类型以及电泳缓冲液的离子组成）。
本视频文章所述的实验流程以 Bis-Tris 非连续缓冲系统结合 4-12% Bis-Tris 梯度凝胶及 MES 电泳缓冲液为例，演示如何使用 Invitrogen NuPAGE 电泳系统进行 Western 印迹实验。在本实验室中，该 Western 印迹方法已在多种生物化学应用中获得良好且可重复的实验结果。
方案
凝胶电泳
技术说明：在开始实验步骤之前，请准备好您的蛋白质样品。
在第一步中，使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）根据样品中蛋白质的分子量进行分离。加入含有十二烷基硫酸锂（LDS）的 NuPAGE® LDS 上样缓冲液，并在 70°C 加热蛋白样品 10 分钟，可使多肽链保持在变性状态。同时使用强还原剂（如 DTT）以破坏二硫键，去除蛋白质的二级和三级结构。此外，样品中的蛋白质会结合大量带负电荷的 LDS，因此在电场作用下向阳极（正极）迁移，并在聚丙烯酰胺凝胶的网状结构中依据分子量大小实现分离（以千道尔顿，kDa 为单位测量）。
样品制备和PAGE实验步骤的详细操作方案可在Invitrogen网站2或NuPAGE技术指南3中找到。
技术提示
- 在 Invitrogen NuPAGE Bis-Tris 不连续缓冲系统中，蛋白质的电泳迁移率以及凝胶的分离范围取决于两个因素：i) 凝胶的丙烯酰胺浓度（丙烯酰胺浓度越高，对低分子量蛋白质的分辨效果越好）和 ii) 电泳缓冲液中的尾随离子 MOPS 或 MES。为选择适合您所需分离范围的合适组合，请参考凝胶迁移图谱1。凝胶的厚度和加样孔数量分别取决于您计划上样的体积和样品数量。
- 当将样品加入凝胶的加样孔时，至少应保留一个泳道用于上样分子量标记物（或称蛋白阶梯）。这些蛋白质标准品可从多家公司购得，通常由一系列具有已知分子量的预染蛋白质混合而成，可在电泳过程中形成可见条带，便于您观察迁移进程。请选择与您所用凝胶分辨率相匹配的分子量范围。
- 为了获得良好且均匀的迁移模式，我们建议在凝胶的所有加样孔中均加入相同体积的样品或 1X LDS 样品缓冲液。
转移
技术说明：在开始转膜步骤之前，配制转移缓冲液（含10%甲醇的1×缓冲液），并在4°C冷室中预冷。
为了使蛋白质能够被抗体检测，需通过电转印将蛋白质从凝胶转移至硝酸纤维素膜上。蛋白质与膜的结合基于膜与蛋白质之间的疏水相互作用以及电荷相互作用。
（聚偏二氟乙烯（PVDF）膜也可作为替代选择。在此情况下，PVDF膜在使用前需用甲醇预湿至少30秒。）
如果使用伯乐（Bio-Rad）Mini Trans-Blot 电泳转移装置，可参考文献4中关于转移步骤的详细操作流程；如果实验室配备的是英坦科技（Invitrogen）XCell II™ 印迹模块，则可参考文献2-3。
经过此过程，蛋白质被暴露在薄膜的表面层上，可进行检测。可通过可逆的丽春红S染料膜染色法检测蛋白质从凝胶向膜转移的均匀性和整体效率。
Ponceau S 染色步骤（可选）：
- 转移蛋白质后，将膜放入孵育盘中（蛋白质面朝上）。
- 加入足量的丽春红S染色液以覆盖膜，并在轻柔振荡条件下孵育至少30秒。
- 用蒸馏水冲洗膜，直至背景清晰。
- 用流动的蒸馏水脱色2-3分钟。
- 将膜放入封闭液中（见下文）。
技术提示：
- 我们建议在蛋白质转膜前用铅笔标记膜，以标明蛋白质暴露的一侧以及样品的方向。
- 转膜后可利用丽春红S染色或分子量标记物来切割膜，以便用不同的抗体分别检测所得的膜片段。
免疫检测：
技术说明：本免疫检测步骤仅作为指导性方案。每种抗体可能需要进行优化；具体信息通常可在市售抗体的产品说明书（如工作稀释倍数、孵育时间等）中找到。
在最后这一过程中，目标蛋白将通过特异性抗体被检测，并在膜上呈现为一条条带。条带的位置取决于目标蛋白的分子量，而条带的强度则取决于样品中目标蛋白的含量。
通常，这一过程分为三个子步骤完成：
- 封闭：为了避免抗体与膜发生非特异性结合（将膜上的空余空间用稀释的通用蛋白溶液覆盖）。
- 孵育一抗：通过特异性primary antibody检测目标蛋白。洗去未结合的一抗后，将膜与另一种连接报告酶enzyme——horseradish peroxidase（HRP）的二抗孵育。该二抗针对一抗的种属特异性区域（e.g. 抗兔二抗可结合任何来源于兔的一抗）。
- 检测：使用化学发光底物，在与二抗上的HRP接触时产生发光反应。该反应在目标蛋白所在位置发光，且光强度与目标蛋白的量成正比。产生的光信号随后由X光胶片捕获。
以下提供一个通用的逐步操作流程。其他详细步骤可参见ECL Plus Western印迹检测试剂说明书5，或大多数 commercially available 抗体所附的数据表。每种抗体的孵育时间、抗体稀释比例以及封闭和洗涤溶液均需通过实验经验进行优化。
免疫检测步骤：
- 使用足量的含1%酪蛋白的PBS封闭液孵育，以封闭非特异性结合位点，确保液体覆盖整个膜。将膜置于摇床上，在室温下孵育至少30分钟，或在4°C下过夜孵育。
- 将膜与针对目标蛋白的一抗共同孵育。一抗应使用封闭液进行稀释。对于大多数抗体，在室温下轻柔振荡孵育1–2小时即可完成结合。或者，也可在4°C下孵育过夜，以提高信噪比。
- 移除溶液（可弃去，或保存于4°C至-20°C以重复使用），并迅速清洗膜一次，随后在室温下用含0.05% Tween 20的PBS（PBST）剧烈振荡洗涤3次，每次10分钟。
- 将膜与用封闭液稀释的HRP标记的二抗共同孵育。选择能够识别一抗来源物种IgG区域的二抗。在室温下轻柔振荡孵育1小时。
- 弃去溶液，并迅速清洗膜一次，随后在室温下用PBST剧烈振荡洗涤3次，每次10分钟。
- 根据制造商说明书进行化学发光检测。我们使用GE Healthcare的ECL Plus Western Blotting Detection Reagents（具体操作详见参考文献5）。
- 将膜放入保鲜膜或密封袋中，并置于放射自显影暗盒内。确保排尽多余液体并去除所有气泡。
- 在暗室中将X光胶片对膜曝光。起始曝光时间为1分钟，随后根据所需信号强度进行调整。
技术提示：
- 通过将膜置于稀释的蛋白质溶液中，可阻断非特异性结合。我们通常使用 1% 酪蛋白，但也可选用牛血清白蛋白（bovine serum albumin，约 2% BSA）或脱脂奶粉（约 5%）作为替代。
- 整个实验过程可使用 Tris-缓冲盐水（TBS）代替 PBS。如果您计划使用磷酸化特异性抗体检测膜，我们建议使用 TBS。
- 在放射自显影胶片暗盒底部贴上夜光贴纸（例如 Stratagene 的 Glogos® II Autorad Markers），有助于在分析步骤中对齐胶片与膜。
分析
现在您已经完成了膜的曝光，会发现实际上并非所有的 Western 杂交结果都能显示出一条清晰单一的蛋白条带。由于一抗和二抗的非特异性结合，可能会出现额外的杂带。通过优化免疫检测步骤，可以降低这种背景信号。此外，设置适当的对照（例如未转染的细胞、siRNA 处理的细胞等）有助于确定抗体的特异性以及目标蛋白在膜上的准确位置。
在膜上标记出染色蛋白质标准品条带的位置后，绘制每个分子质量的对数值 蛋白标准品（y轴）与其对应值 相对迁移率 （横轴）。相对迁移率（Rf）是指蛋白质从其起始位置（凝胶顶部）迁移的距离与示踪染料或低分子量标记物迁移距离（即凝胶前沿）的比值。通过标准曲线确定回归直线，获得斜率和y轴截距的数值。利用目标蛋白的Rf值及以下修正公式，可估算其未知的分子量（大小）：
log 分子量 = (斜率)(目标蛋白的迁移率或 Rf 值) + y 轴截距
（详细说明请参见参考文献6）。
通过将目标蛋白的条带强度与结构蛋白（如微管蛋白或肌动蛋白）或持家基因产物（如GAPDH）的条带强度进行比较，来估算表达水平。这种所谓的“上样对照”在不同样品之间不应发生变化，并通过使用特异性的一抗来显现。还可通过密度分析对图像进一步分析，以评估蛋白染色的相对含量，并以光密度值对结果进行定量。
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讨论
本文所述实验流程以使用Invitrogen NuPAGE Novex电泳系统的Bis-Tris凝胶配合MES电泳缓冲液为例，介绍变性PAGE的操作。此外，这种预浇制凝胶系统既可用于变性条件也可用于非变性条件下蛋白质的分离，并可适用于较宽范围的分子量（Bis-Tris凝胶为1-200 kDa，Tris-乙酸凝胶为36-400 kDa）。根据实验需求，您可选择仅采用此处描述的Western印迹技术中的部分步骤，转而使用直接凝胶染色方法（如银染或考马斯亮蓝染色），或采用其他免疫检测方法（如比色法或荧光法）。
我们在实验室中常规使用Invitrogen NuPAGE Novex电泳系统进行多种应用，一些示例可参见参考文献7-9。
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致谢
本工作获得了美国国立卫生研究院和乔治·E·休伊特基金会研究员项目（A.P.）的资助。
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参考文献
- Gel Migration chart: . , http://www.invitrogen.com/etc/medialib/en/filelibrary/pdf.Par.99253.File.dat/O-063575-NuPage_fin.pdf Forthcoming.
- Complete western-blot protocol from the Invitrogen website. , https://commerce.invitrogen.com/index.cfm?fuseaction=iProtocol.unitSectionTree&treeNodeId=A2C5758BC7C3438B01378A0940376C8E Forthcoming.
- NuPAGE technical guide. , http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/nupage_tech_man.pdf Forthcoming.
- Instruction Manual, Mini Trans-Blot Cell. , http://www.bio-rad.com/cmc_upload/0/000/013/280/M1703930E.pdf Forthcoming.
- ECL Plus Western blotting detection reagents instruction. , http://www5.gelifesciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/139B41E53EDC6210C1256EB40044ACE3/$file/RPN2132PL_Rev_D_2006_web.pdf Forthcoming.
- Estimation of protein molecular weights by SDS gel electrophoresis, GE Healthcare Website. , http://www1.gelifesciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/elpho_applications~elpho_applications_1d_protein_analysis~elpho_sds_page~Elpho_1D_SDS+PAGE+2+Estimation+of+protein+molecular+weights+by+SDS+gel+electrophoresis+~3.+Procedure Forthcoming.
- Yeromin, A. V., et al. Molecular identification of the CRAC channel by altered ion selectivity in a mutant of Orai. Nature. 443, 226-229 (2006).
- Zhang, S. L., et al. Store-dependent and -independent modes regulating CRAC channel activity of human Orai1 and Orai3. J. Biol. Chem. 283, 17662-17671 (2008).
- Penna,, et al. The CRAC channel consists of a tetramer formed by Stim-induced dimerization of Orai dimers. Nature. , Forthcoming.
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重印与许可
