在不对称受体图案上研究细胞滚动轨迹

摘要

我们描述了一种用于观察和分析细胞在不对称受体图案化基底上滚动轨迹的实验方案。所得数据可用于设计用于无标记细胞分离与分析的受体图案化基底。

摘要

细胞在不对称受体图案上滚动时，会垂直于流动方向发生侧向位移，这一现象为开发新型无标记细胞分离与分析装置提供了可能¹。此类装置可利用侧向位移实现连续流动分离，或通过调控黏附的受体图案来区分不同细胞表型或受体表达水平。要设计此类装置并优化受体图案化基底，必须深入理解细胞在受体图案化基底上的滚动轨迹特性。

在此，我们展示了一种用于研究细胞在支持细胞滚动黏附的不对称受体图案上滚动轨迹的实验方案。²界限清晰的， μ采用微接触印刷技术在镀金载玻片上制备微米级P-选择素受体图案，并将载玻片整合至流动腔室中。表达PSGL-1配体的HL60细胞 ³在倒置明场显微镜下观察细胞流经图案化线条区域的情况。细胞沿图案的倾斜边缘滚动并定向移动，产生侧向偏转。¹每个细胞通常会沿着图案边缘滚动一段特定距离（定义为边缘追踪长度），随后从边缘脱离，并重新附着到下游的另一个图案上。尽管这种脱离现象使得难以追踪细胞从流动室入口到出口的完整轨迹，但通过使用颗粒追踪软件，仍可分析并获得细胞在单个受体图案化线条上滚动期间的运动轨迹。随后对这些轨迹进行分析，以获取不同图案下细胞滚动速度及每个细胞的边缘追踪长度的分布情况。

该方案可用于量化细胞在受体图案上的滚动轨迹，并将其与图案角度和剪切应力等工程参数相关联。此类数据将有助于设计用于无标记细胞分离和分析的微流控装置。

方案

1. HL60 细胞滚动

1.1. 图案化基底的制备。

1. 使用微接触印刷（μCP)^4-7 在镀金玻璃片上制备交替的聚乙二醇（PEG）分子自组装单层（SAMs）：制备微接触印刷用聚二甲基硅氧烷（PDMS）印章，以定义具有倾斜角度的受体图案 α = 10° 通过SU-8模塑工艺实现。用piranha溶液（浓硫酸与30%过氧化氢按3:1比例混合）清洗金表面20分钟，随后用大量去离子水在24.5℃下冲洗表面 °使用前将PDMS印章在5 mM PEG乙醇溶液中染色。将印章在空气中干燥20分钟。轻轻将印章贴合于金表面，持续40秒，确保金表面与印章之间接触良好，无需施加额外压力。用乙醇冲洗表面，并在氮气流下吹干。₂.
2. 将底物孵育于P-selectin溶液（15 μg/mL，在DPBS中）使用灌流室（Electron Microscopy Sciences）在24.5℃下孵育3小时°用 C 在剩余区域进行 P-选择素的图案化。用大量 DPBS 冲洗表面。
3. 用 BSA（1 mg/mL 溶于 DPBS）封闭表面 1 小时，以阻断非特异性相互作用。  用大量 DPBS 冲洗表面。

1.2. 流动腔室中的细胞滚动实验。

1. 在24.5°C条件下，将HL60细胞悬浮液（约10⁵ 个细胞/mL）以75 μL/min的流速，通过矩形流动腔室（Glycotech, Inc；宽度 w = 1.0 cm；长度 = 6 cm；高度 h = 0.0127 cm）流经图案化表面。使用注射泵（World Precision Instruments, SP230IW）产生流动，对应的剪切应力约为0.5 dyn/cm²（~0.05 Pa）。通过平面泊肃叶流动方程 τ = 6μQ/wh² 计算剪切应力τ，其中μ为运动粘度（0.001002 Pa·s），Q为体积流速，w为流动腔室宽度，h为流动腔室高度。
2. 使用倒置显微镜（Nikon TE2000-U）配合连接的相机（Andor iXon 885），采用4×物镜记录HL60细胞在黏附性P-选择素基底上的滚动相互作用，通常以每秒1帧的速度连续记录300秒。针对每种剪切应力大小和图案倾斜角度，进行三次独立实验。数据以各次实验所得平均值的均值±标准差形式呈现。
3. 数据分析。
   使用定制的Matlab程序（Mathworks, Inc.）分析图像序列，该程序结合一种粒子追踪免费软件⁸，沿图案化线条边缘生成轨迹。选择延伸至P-选择素条带末端的轨迹，并将其拟合为两条直线段——一条与流动方向对齐，另一条与图案边缘对齐。利用这两条线段计算边缘追踪长度、在边缘上的滚动速度以及在平坦区域上的滚动速度。

2. 代表性结果：

图 (A) 显示了使用 4× 物镜从 HL60 细胞在粘附性 P-选择素基底上滚动相互作用的视频中转换得到的显微镜图像之一。亮区和暗区分别对应 P-选择素受体区域和聚乙二醇（PEG）区域。图 (B) 显示了使用定制的 Matlab 程序获得的轨迹。边缘倾斜角度为 10°，剪切应力为 0.5 dyn/cm²。边缘追踪长度 l_e、位移 d，以及边缘和条带内部的滚动速度 V_e 和 V_p 分别在 图 (C-1) 中进行了说明。图 (C-2) 显示了边缘追踪长度的分布（记录的细胞数量）。插图显示了在倾斜角 α = 10° 且流体剪切应力大小约为 0.5 dyn/cm² 时，l_e 的平均值以及边缘（V_e）和条带内部（V_p）的滚动速度。误差棒表示一个标准偏差，其中每种条件均进行了 n = 3 次重复实验（3 个重复表面）。

讨论

我们已描述了一种利用微接触印刷技术制备的不对称受体图案化表面来研究细胞滚动轨迹的实验方案²。通过光学显微镜观察图案化表面，可清晰区分PEG区域与P-选择素区域，从而验证印刷是否成功。当印刷操作良好时，可观察到边缘清晰、笔直。若对印章施加过大的压力，可能导致印章变形，从而降低图案的精确度。当墨水浓度过高或印刷时间过长时，可能产生波浪状边缘。当印章尺寸过小（<0.5 cm²）时，印章与表面接触不良会导致PEG图案不均匀。使用非新鲜配制的墨水溶液可能导致细胞在PEG图案化区域发生滚动，原因是其钝化P-选择素的能力下降。实际倾斜角度可通过图案图像以及未与表面相互作用的自由流动细胞的轨迹图像计算得出。本实验可提供关于单个细胞沿图案边缘滚动事件的信息；然而，对于脱离一个图案后又重新附着到另一图案上的细胞，自动追踪其运动轨迹较为困难。通过调整图案间距等方法，可能实现对单个细胞连续经过多个边缘的追踪。该能力有望在单细胞水平上更精确地区分具有不同滚动特性的细胞。由于细胞滚动行为依赖于细胞表面的配体，我们推测此类实验可能有助于设计合适的图案，以基于细胞滚动行为的差异实现不同细胞表型的分离^{3, 9-...}

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
人早幼粒细胞白血病细胞	ATCC	CCL-240	HL60 细胞
金镀膜玻片	EMF	TA134	金玻片
(1-巯基十一烷基)四(乙二醇)	Sigma-Aldrich	674508	PEG
重组人 P-选择素	R&D Systems	ADP3-050	P-selectin
牛血清白蛋白	Rockland Immunochemicals	BSA-50	BSA
Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液	Mediatech, Inc.	21-030	DPBS
硫酸	Sigma-Aldrich	339741
过氧化氢	Sigma-Aldrich	316989