蝎子 peg 感觉刺的电生理学

摘要

本文介绍了一种电生理学方法，通过在矿物油下进行细胞外尖端记录，实现对单个感器的化学刺激进行分离。

摘要

我们介绍了一种对现有尖端记录技术^1,2的改进方法，用于电生理学研究短小、钉状的感觉毛状感器^3,4。所有蝎子的腹面中部均具有一对称为栉器的附肢，其上分布着密集的机械感受和化学感受钉状感器^5,6。评估这些感器化学反应性的一种方法是使用钨电极，在向感觉区域引入挥发性气味物质时，记录感器内的细胞外神经活动^5,7。该方法的局限性包括数据采集速度慢，以及对钉状感器区域施加和清除刺激物的过程缺乏控制。为克服这些局限，我们开发了一种新的尖端记录技术，采用非极性矿物油作为介质，将水溶性味觉刺激物递送至单个钉状感器^8,9。我们已成功应用该方法获得了感器对柠檬酸、乙醇和盐的化学反应。本文将描述该研究的实验方案⁹。我们认为，这种新方法可能适用于研究其他节肢动物化学感受系统，包括昆虫^{10, 11}和甲壳类动物¹²的化学感受特性。

方案

1. 录制前的活体动物准备

1. 将蝎子从其栖息的容器中取出，放入预先冷却的玻璃容器中；随后将装有蝎子的容器置于冷冻环境（-5 °C）中至少两分钟。具体时间可能因所研究蝎子的年龄、体型、种类等因素而有所不同。但通常情况下，当动物完全静止不动时，即表明冷冻阶段已完成。
2. 两分钟后，将已固定不动的蝎子从低温玻璃容器中取出，腹面朝上放置于显微镜载玻片上。使用可塑性黏土（油性，Van Aken Plastalina）固定其毒刺、尾部、足和须肢。
3. 制作一个用于放置蝎子栉器的平台。根据栉器的大小调整平台的长度和宽度。通常，我们的平台由显微镜盖玻片制成，尺寸约为10（长）× 18（宽）mm。
4. 在栉器平台上粘贴双面胶带，并根据需要修剪胶带以使其贴合平台。
5. 为构建栉器腔室，将平台四边中的三边浸入已预熔的蜡中（我们使用100%纯蜂蜡碎片），浸入深度为3–4 mm。通过将蜡碎片置于玻璃培养皿中并放置于加热板上进行熔化。待栉器腔室边缘的蜡冷却至室温后，应形成约1 mm高的蜡壁。
6. 在动物体上确定栉器插入的位置，将平台未涂蜡的一边（胶带面朝上）紧贴该位置后方放置。随后，轻轻按压平台左右两侧边缘，使其与用于固定动物足部的黏土贴合，以稳定平台，防止其后续移动。
7. 使用尖头镊子小心地将栉器或一对栉器放入腔室内。具体操作为：用镊子夹住栉器的栉齿主干，沿盖玻片下方缓缓将栉器拉出，并轻柔地将其放置于带胶的平台底部。通过小心施加压力于栉齿主干，使栉器与胶带牢固粘合。
8. 现在将熔化的蜡（我们使用预热的金属刮刀）涂抹在平台未封蜡的边缘。此步骤具有双重目的：一是固定栉器，二是完全封闭腔室，以便后续引入矿物油。在将蜡覆盖于动物栉器上方时需格外小心，避免因蜡温过高而损伤栉器。
9. 栉器腔室构建完成。接下来，通过将一根银丝插入尾部两个体节之间，建立与动物血淋巴的无关电极连接。

2. 同时进行细胞外记录与化学刺激

1. 我们于进行细胞外尖端记录前24小时准备实验动物，这一时间安排除了便于动物适应固定体位外，还可用于定制具有特定（依感受器而定）尖端直径的刺激电极毛细管。我们使用微电极拉制仪来制备符合此类规格的毛细管。理想情况下，毛细管的尖端直径为 ≈ 2 μ比感受器孔径大，我们针对每只动物相应调整微移液管的规格。
2. 记录前1小时，我们加入5 μ向栉膜腔内加入矿物油，使栉膜完全浸没于油中。然后将动物置于配备长工作距离物镜和落射照明的高倍显微镜下。
3. 为了化学刺激刺形感器，我们通过油介质引入水溶性味觉刺激物（即柠檬酸和盐）。首先，使用微管填充器将刺激物注入刺激用移液管中。注意：所有刺激物溶液都应含有电解质以保证电导性。
4. 接下来，将刺激电极移液管固定在记录装置的显微操作器上后，将记录电极插入刺激电极移液管钝端的开口处。必须确保金属电极与电解刺激溶液之间形成良好接触。
5. 一旦准备就绪并通过无关电极实现电学接地，只需将移液管穿过油相介质并接触感器孔即可。对每个栉状感器的化学刺激持续时间可从长达三十分钟到短至一秒不等。通常情况下，我们可以对多个小杆状结构进行采样（> 30）每支移液管。如果刺激用移液管被微小碎屑堵塞，只需将堵塞的移液管更换为一支新的、未使用过的移液管即可。

3. 准备用于多天实验的动物

1. 如果需要在较长时间内重复使用该动物，我们建议重复使用栉状腔，并在每次记录会话中更换矿物油液滴。在当天的记录会话结束后，将动物从记录装置中取出，并进行矿物油清洗。
2. 具体操作为：向腔内再加入一滴（5 μl）矿物油，然后将所有油液移除。此步骤有助于最大限度减少残留刺激物的存在，这些刺激物可能在记录过程中从移液管中渗漏出来。
3. 在下一次记录会话前，按照前述方法加入一滴矿物油。

4. 代表性结果：

根据所使用的记录设备（例如特定的放大器、数字化硬件等），典型结果应为信噪比至少达到3:1的细胞外记录。

成功构建矿物油腔室对于将化学刺激限制在单个感受器内至关重要，因为它为递送极性（水基）化学味觉刺激物提供了一种介质⁸。如果矿物油过少或完全缺失，刺激溶液将从被记录的感受器扩散至邻近的感受器，可能导致持续且不受控制的化学刺激⁸。

讨论

上述方案描述了如何准备一种沙漠草原蝎（Paruroctonus utahensis用于电生理学研究。具体而言，我们展示了如何构建一个可在油相环境下对栉器化感神经元进行可控细胞外尖端记录的记录室。由于油相与水相不相混溶，因此可将基于水相的化学刺激精确限定于单个感觉器。需要强调的是 P. utahensis是一种相对较小的动物（≈ 2.5–5 cm），将本方案应用于较大的动物时，可能需要进行多项尺寸调整，例如动物平台、腔室的大小以及所用油的用量。我们建议开展预实验，以测试实现水溶性化学刺激物可控递送所需的最低油用量。

此外，我们发现油对pectinal sensilla内的基础神经活动没有影响⁸。在评估化学感受性之前，也应针对其他模型系统验证这一结果。

该方法可与其他方法结合使用，以检测感觉区域中感受器之间化学响应的相互作用效应。例如，可在油下对一个感受器进行尖端记录，同时通过钨电极对邻近的感受器进行基部记录⁹。这种记录配置可用于评估化学刺激一个感受器是否会影响基部记录感受器的神经活动。迄今为止，尚无人对蝎子栉状器感受器进行过此类测试，这一问题在其他化学感受系统中也仍然有待研究。

总之，我们认为在油下进行尖端记录的方法拓展了电生理学研究节肢动物味觉神经基础的范围。在本文中，我们提供了一套用于该方法的动物准备方案，希望为外周感觉神经系统进一步的研究奠定坚实基础。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Lift-N-Press 标签	Ted Pella, Inc.	16082	双面粘合剂
MicroFil	World Precision Instruments, Inc.	MF34G	微量移液管填充器
标准玻璃毛细管	World Precision Instruments, Inc.	1B100F-6	玻璃移液管
Micr–lectrode Holder	World Precision Instruments, Inc.	MEH3SBW10