建立和传代人视网膜母细胞瘤肿瘤在免疫缺陷小鼠中的模型

摘要

介绍了一种在小鼠体内传代人视网膜母细胞瘤肿瘤的方法。将肿瘤细胞直接注射到免疫缺陷小鼠的眼内。该方法已成功用于建立继发性肿瘤，所用细胞既包括直接从人肿瘤组织中获取的细胞，也包括培养的肿瘤球细胞。

摘要

在特定的干细胞培养基中培养视网膜母细胞瘤肿瘤细胞可形成原代肿瘤球，但这些肿瘤球仅能短期生长和维持。与原始肿瘤相比，这些体外培养的肿瘤球可能表现出显著不同的细胞表型。验证培养后的细胞是否仍具有形成新肿瘤的能力，对于确保培养细胞能够真实模拟原始肿瘤的生物学特性至关重要。

本文介绍了一种人视网膜母细胞瘤肿瘤传代培养的实验方案 体内 使用 Rag2^-/- 免疫缺陷小鼠。将低代次培养的人视网膜母细胞瘤肿瘤球或从新鲜收获的人视网膜母细胞瘤肿瘤中分离的细胞直接注射至小鼠眼玻璃体腔内，可在2-4周内形成肿瘤。这些肿瘤可被收获后进一步传代接种至小鼠眼内 体内 或以肿瘤球形式培养 体外已成功连续传代至少三次，从而建立了可持续提供的人类视网膜母细胞瘤组织来源，可用于进一步实验。

Wesley S. Bond 和 Lalita Wadhwa 为共同第一作者。

方案

1. 视网膜母细胞瘤肿瘤球的制备

1. 根据经机构审查委员会（IRB）批准的方案获取视网膜母细胞瘤肿瘤样本。
2. 配制新鲜的无血清干细胞培养基（Neurobasal-A 培养基，1X B-27 补充剂不含维生素A，1X 非必需氨基酸溶液，1X L-谷氨酰胺，20 ng/mL EGF，10 ng/mL bFGF）。
3. 在无菌条件下，使用手术刀在经组织培养处理的6孔板中采用交叉切割法对肿瘤组织进行机械解离。立即向组织中加入100 μL无血清干细胞培养基，并用手术刀轻轻铺开切碎的组织。每孔再加入5 mL无血清干细胞培养基。
4. 置于37°C、5% CO₂的湿化培养箱中培养，每日观察。部分肿瘤球几乎可立即从破碎的肿瘤组织中形成，并在2至4天内数量逐渐增加。
5. 每周以300×g离心5分钟收集肿瘤球，重悬于新鲜配制的无血清干细胞培养基中，吹打10次，以破碎较大且中心坏死的肿瘤球，促进新的健康肿瘤球形成。

2. 注射用肿瘤细胞的制备

1. 若注射培养的肿瘤球，先将肿瘤球轻柔地用移液器转移至15 mL圆锥管中。用血清移液管轻柔吹打10–15次，以充分分散肿瘤球。
2. 使用血细胞计数板对拟注射的细胞进行计数，并将每份不少于50,000个细胞分装至新的离心管中。根据可用细胞数量，尽可能准备相应数量的注射样本。
3. 以300×g离心5分钟。小心吸除上清液，加入5 mL PBS重悬细胞。重复一次离心及上清去除步骤，最后按每份注射样品10 μL PBS重悬细胞。

3. 动物准备

1. 使用胰岛素注射器，按照每千克体重 0.01 mL 的剂量，向腹腔内注射麻醉混合液（氯胺酮 37.6 mg/mL，赛拉嗪 1.92 mg/mL，乙酰丙嗪 0.38 mg/mL） 1 μL 每克体重（gbw）。等待5分钟，使动物进入镇静状态。检查心跳，并将动物置于加热垫上。在恢复前，始终将动物保持在加热垫上。
2. 镇静后，向右眼滴加1滴盐酸丙帕卡因。将动物放回加热垫上，等待1分钟。
3. 向右眼滴加1滴盐酸去氧肾上腺素。将动物放回加热垫上，等待5分钟。若瞳孔未扩张，再次滴加1滴，并继续等待5分钟。
4. 监测动物是否出现活动或抽搐迹象，这些现象可能发生于 >镇静后30分钟。一旦出现最初的动作迹象，立即给药 1 μL/gbw 盐酸氯胺酮（用PBS稀释至10 mg/mL）并等待5分钟。

4. 肿瘤细胞注射

1. 将麻醉后的动物侧置于显微镜下，右眼朝上，头部 resting 在纱布上并居中，通过显微镜观察时应可见右眼眼底的红光反射（此时瞳孔应已散大）。
2. 用两根手指轻轻按压眼睑，同时向下施力以支撑右眼球，并在后续操作中保持此位置稳定。
3. 使用连接至鲁尔锁紧式注射器的无菌30号针头，从角膜缘附近平坦部区域的结膜和巩膜侧方穿入，穿透脉络膜进入玻璃体腔（图1）。随后将针头从穿刺口移除。
4. 用酒精棉片对Hamilton针进行消毒。将细胞悬液吸入Hamilton注射器中，并将针头插入切口，直至在显微镜下可见针尖位于晶状体后方玻璃体靠近视网膜的位置。在另一人协助下保持针头位置稳定，缓慢推动注射器推杆。随后拔出针头。如有必要，可用棉签吸去切口处的液体。
5. 轻轻松开对眼睑的压力，使小鼠眼睑闭合。
6. 每只眼睛滴入1滴羟丙甲纤维素，并将动物放回加热垫上恢复。

5. 注射小鼠的监测与肿瘤组织的采集

1. 每日检查注射眼是否存在白瞳症（白色瞳孔反射）和/或眶周肿胀，这些症状通常在注射后2-4周变得明显。
2. 一旦检测到肿瘤生长，根据机构指南实施动物安乐死。
3. 若眼球和肿瘤被眼睑覆盖，使用手术刀沿睑裂垂直方向做两个切口，并掀开皮肤瓣。
4. 在体视显微镜下观察，于角膜缘处做环形切口，移除角膜和晶状体，并用镊子小心将大部分肿瘤组织与其他组织分离。将肿瘤置于无菌RPMI-1640培养基中。
5. 用镊子缓慢将眼球从眼眶中拉出。为确保视神经附着以便观察肿瘤浸润情况，应将眼球拉出至视神经暴露，然后用剪刀尽可能保留较长的视神经段进行剪断。将标本置于10%福尔马林中，常规处理后用于组织学检查。

6. 代表性结果：

视网膜母细胞瘤肿瘤球将从离散的组织中几乎立即开始出现，因为它们从肿瘤团块中被释放出来。在2-4天内，将有更多肿瘤球开始形成，并逐渐增大。这些球体通常形态规则，表现出围绕细胞团的清晰、结构完整的次级膜（图2）。

动物通常在注射后4周内出现白瞳症（图3b），随着肿瘤生长，注射后5至8周眼球增大，周围组织扩张（图3c）。

图1. 小鼠眼球的横截面示意图，突出显示本实验方案中提及的结构。

图2. 人视网膜母细胞瘤细胞培养 体外 成像于 a) 4x，以及 b) 10倍物镜放大倍数。视网膜母细胞瘤原代肿瘤细胞形成具有规则球形形态和清晰外膜的肿瘤球。比例尺表示 a) 500 μm，以及 b) 200 μm.

图3. Rag2-/- 小鼠的眼部，显示 a) 正常特征，b) 玻璃体腔内肿瘤团块所致的白瞳症，以及 c) 大型肿瘤团块充满眼球，伴有眶周扩张和眼内出血。

讨论

本文所述技术可促进视网膜母细胞瘤在眼内、玻璃体内的微环境中生长。眼内注射技术过去已被用于由视网膜母细胞瘤来源的细胞系建立肿瘤¹，以及递送用于眼内基因治疗的病毒载体^2,3。该技术现已成功应用于通过直接注射原发肿瘤细胞、肿瘤球（tumorspheres）以及连续传代异种移植瘤来生成人源视网膜母细胞瘤。通常在注射后4周内即可观察到肿瘤形成的可见迹象（通常为白瞳症），随后在5至8周内出现眼内出血及眼球或眶周组织的肿胀。少数注射小鼠会损伤注射眼，导致眼睑永久闭合。在此类情况下，肿胀是肿瘤形成的唯一征象。

并非所有人类视网膜母细胞瘤都能成功建立小鼠异种移植瘤，尽管已建立的异种移植瘤在小鼠体内传代非常成功。这一现象提示，原发肿瘤的某些特性，如侵袭性、分化程度或其他未知因素，可能影响这些肿瘤在小鼠眼内环境中的存活能力。

从人类视网膜母细胞瘤肿瘤中获取的组织量非常有限，且在培养人类视网膜母细胞瘤细胞方面存在显著限制 体外 例如有限的寿命、实体瘤组织学特征的丧失以及细胞表型的改变。本方案提供了一种相对简便的方法来扩增人类肿瘤并建立人类疾病的鼠类模型，从而允许进一步研究 体外 和 体内 视网膜母细胞瘤生物学特性的实验研究及肿瘤离体后的长期维持

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
盐酸去氧肾上腺素 2.5%	Bausch and Lomb	053-11	滴眼液
30 号针头	BD Biosciences	305128	普通斜面
10 mL 鲁尔锁注射器	BD Biosciences	309604
3/10 cc 胰岛素注射器	BD Biosciences	328431
酒精棉片	BD Biosciences	326895
6 孔板，组织培养处理	BD Biosciences	353046
盐酸丙帕他卡因 0.5%	Butler Animal Health Supply	017239	滴眼液
盐酸氯胺酮 100 mg/mL	Fort Dodge Animal Health	4402A
10-μL Hamilton 注射器	Hamilton Co	7648-01
32 号 Hamilton 针头	Hamilton Co	7803-04	定制长度 - 0.5"
Neurobasal-A 培养基	Invitrogen	10888-022
B-27 添加剂（不含维生素 A），50X	Invitrogen	12587-010
RPMI-1640 培养基	Mediatech, Inc.	10-040-CV
非必需氨基酸溶液，100X	Mediatech, Inc.	25-025-CI
L-谷氨酰胺，100X	Mediatech, Inc.	25-005-CI
一次性 #11 手术刀	Miltex Inc.	4-411
啮齿类动物麻醉混合液	N/A	n/a	本院药房配制（氯胺酮 37.6 mg/mL，赛拉嗪 1.92 mg/mL，乙酰丙嗪 0.38 mg/mL）
重组人表皮生长因子（EGF）	Stem Cell Technologies	02633	重悬为 10 μg/mL 储存液
重组人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）	Stem Cell Technologies	02634	重悬为 10 μg/mL 储存液
OMS-75 手术显微镜	Topcon Medical Systems	OMS-75	该型号已停产
10% 福尔马林	VWR international	95042-908