通过质粒显微注射分析极化上皮细胞中小GTP酶的功能

摘要

本文详细介绍了利用显微注射技术在极化上皮细胞中过表达和分析小GTP酶的相关操作步骤。

摘要

上皮细胞将其质膜极化为生化和功能上截然不同的顶膜和基底外侧膜区域，其中顶膜面向“游离”表面，而基底外侧膜则与基质及邻近细胞接触。这两个膜区域由紧密连接分隔，形成扩散屏障。当上皮细胞（如Madin-Darby犬肾（MDCK）细胞）以高密度接种于聚碳酸酯滤膜上并培养数天时，可在体外成功重现顶-基底外侧极性^{1 2}。细胞极性的建立与维持受Ras超家族的小GTP酶调控，其中包括RalA、Cdc42、Rab8、Rab10和Rab13^{3 4 5 6 7}。与所有GTP酶一样，这些蛋白在无活性的GDP结合态与有活性的GTP结合态之间循环。核苷酸结合区的特定突变会干扰这一循环过程⁸。例如，Rab13T22N永久性地锁定在GDP形式，因此被称为“显性负性”突变体；而Rab13Q67L则无法水解GTP，因而被锁定在“显性活性”状态⁷。为了分析这些蛋白在细胞中的功能，通常需高水平表达GTP酶的显性负性或显性活性等位基因，以干扰内源性蛋白的功能⁹。一种在短时间内实现高水平过表达的巧妙方法是，利用显微注射技术将编码目标蛋白的质粒直接导入生长在滤膜支撑物上的极化细胞的细胞核中。该方法常与共注射报告性质粒联合使用，后者编码特异性分选至顶膜或基底外侧膜的质膜受体。常用于分析向基底外侧膜分选的运输货物是一种水疱性口炎病毒糖蛋白（VSVGts045）的温度敏感型等位基因¹⁰。该蛋白在39°C下无法正确折叠，因而滞留在内质网（ER）中，而此时感兴趣的调控蛋白正在细胞质中组装。将温度转移至31°C后，VSVGts045可正确折叠，离开内质网并转运至质膜¹¹。这一追踪过程通常在环己酰亚胺存在下进行，以抑制新蛋白的合成，从而获得更清晰的结果。本文详细描述了将质粒显微注射入极化细胞以及后续包括温度转换在内的孵育步骤，以便全面分析参与基底外侧膜分选的调控蛋白。

方案

1. 质粒DNA的提取

1. 使用 Sigma-Aldrich 内毒素去除型大提试剂盒，按照制造商提供的方案制备无内毒素的 DNA。该试剂盒效果可靠，能够有效去除 DNA 制备物中的任何内毒素。若将含有内毒素的 DNA 注入细胞核，会导致细胞死亡。
2. 向分离得到的 DNA 中加入 100 μl 苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），涡旋混匀后，在 Eppendorf 微型离心机中以 13,000 rpm 离心 1 分钟。将上层水相转移至新离心管中，再加入 100 μl 氯仿/异戊醇（24:1），同样进行涡旋和离心操作。将含有 DNA 的上层水相转移至另一新管中。此步骤可去除 DNA 中残留的蛋白质，防止微注射针头堵塞。
3. 通过加入乙酸钠（pH 6.0）至终浓度 300 mM 以及 2 倍体积的 100% 乙醇来沉淀 DNA。于 -20°C 孵育过夜。在 Eppendorf 微型离心机中以 13,000 rpm 离心 20 分钟，收集 DNA 沉淀，用 70% 乙醇洗涤一次，最后重悬于 300 μl 无内毒素水（Sigma-Aldrich）中。
4. 测定 DNA 浓度。典型的 DNA 浓度范围为 1 至 5 μg/μl。

2. MDCK 细胞的培养

1. 传代MDCK细胞。计数细胞后，将4 × 10⁵个细胞接种至透明的12 mm Transwell小室（孔径0.4 μm，Corning Costar，3460）。若实验包含一个模拟注射对照组和两种不同的Rab突变蛋白，则需接种三个小室。
2. 在MEM培养基（含2 mM L-谷氨酰胺、0.1 mg/ml青霉素/链霉素和7%（体积比）胎牛血清，即MEM生长培养基）中，于37°C、5% CO₂条件下培养MDCK细胞。
3. 每天更换基底外侧腔室中的培养基。此举有助于细胞极化过程，因其模拟了动物体内上皮细胞的生理环境。
4. 接种后第2天，在显微镜下检查细胞是否形成完整的单层。若单层中无可见孔隙，则可在第3天进行实验；若仍有孔隙，则在第4天进行实验。

3. 显微注射操作及注射后孵育

1. 实验当天，为每个滤膜准备一个60 × 15 mm培养皿，其中加入5 ml MEM生长培养基和50 mM HEPES，并置于39°C培养箱中。此外，为每个滤膜在12孔板中设置一个孔，加入1 ml MEM生长培养基、50 mM HEPES和0.1 mg/ml环己酰亚胺，并置于31°C培养箱中。
2. 打开显微注射显微镜，并将加热载台设定为39°C。我们使用倒置显微镜（Axiovert 200，Carl Zeiss MicroImaging, Inc.），配备加热载台、10X和32X物镜，以及Eppendorf Femtojet（Injectman NI2）。最后，打开为气浮台供气的氮气罐。
3. 用滤过水（使用0.2 μm滤器）将DNA稀释至最终浓度为0.2 mg/ml，总体积为10–100 μl。随后，在Eppendorf微量离心机中以13,000 rpm离心30分钟。取上清液转移至新管中。此步骤可确保将稀释后的DNA加载到显微注射针时，能够准确加载“纯净”的DNA。此时DNA已准备好用于显微注射。
4. 取出第一个滤膜培养皿中的滤膜。使用手术刀（Feather Surgical Blade，不锈钢，No 11）将滤膜从滤膜支架中切下，并放入含有5 ml、39°C预热的MEM生长培养基加50 mM HEPES的培养皿（60 × 15 mm）中。用之前切割滤膜所用的手术刀压住滤膜。将手术刀放置在滤膜上，使其孔洞包围滤膜中心。将培养皿置于显微镜的加热载台上。
5. 将2–3 μl稀释后的DNA（本例中为编码VSVGts045-GFP的质粒 = 模拟注射对照）装入显微注射针（Femtotip II，Eppendorf，930000043）中，旋转取下针头保护帽并弃于地面。此时针头可安装至针夹中。操作时，按下Injectman的菜单键，确保阀门关闭。将针头旋入针夹，注意不要旋得过紧，以免导致针头断裂。再次按下菜单键，设定的P_c压力可防止在显微注射过程中培养基被吸入针头。最后，轻触操纵杆以清除已存储的归位信息。
6. 使用10X物镜将针头下降至细胞上方。将针头移至液体上方的光路中，聚焦于细胞，然后将聚焦旋钮向上旋转180°，再次提升焦平面以找到针头。随后缓慢将针头移入焦平面，再移出焦平面（逐步调整使细胞重新进入焦点），再次将针头降入焦点。重复此过程，直至针头接触培养基表面，此时视野中仅可见一个光晕。当细胞处于焦点而针头仍模糊（即不在焦平面内）时，切换至32X物镜并调整粗/细焦旋钮。
7. 通过针尖接触顶膜并减去约10 μm来设定z轴限位，因为细胞核位于顶膜下方约10 μm处。
8. 设定z轴限位后，调整合适的注射压力。起始压力设为95 PSI。若压力过高，细胞会破裂；若压力过低，则仅见一个持续存在的白点而无其他变化。成功注射时，可见相位变化但细胞大小不变。注射时，迅速将针头移出焦平面数微米，将针头对准细胞核上方（即单个细胞的中心），按下操纵杆上的注射按钮，但不要持续按住。
9. 在覆盖于细胞上的手术刀孔洞范围内注射100–500个细胞。完成后，将细胞连同培养皿和手术刀一起放回39°C培养箱，孵育2小时。在此期间，VSVGts045-GFP表达并分泌至内质网。然而，在39°C下，VSVGts045-GFP无法正确折叠，因此不能离开内质网。同时，在共注射实验中，目标小GTP酶将在细胞质中积累。
10. 2小时后，将细胞转移至含1 ml MEM生长培养基、50 mM HEPES和0.1 mg/ml环己酰亚胺的12孔板中，在31°C下继续孵育2小时。在此追踪阶段，VSVGts045-GFP将正确折叠，离开内质网并被运送至细胞表面。
11. 对第二个滤膜（注射编码VSVGts045-GFP及例如V5标记的Rab13T22N的质粒）和第三个滤膜（注射编码VSVGts045-GFP及例如V5标记的Rab13Q67L的质粒）重复步骤3.1–3.10。每次注射约需20–60分钟。然而，在整个温度转换孵育和表面染色过程中，直至固定细胞前，必须以完全相同的方式处理每个滤膜。固定后，可同时对所有滤膜进行后续染色操作。

4. 免疫荧光分析的表面染色

注意，为避免VSVGts045-GFP的GFP信号发生漂白，在后续所有操作中需用铝箔覆盖样品以避光。

1. 若需进行表面染色，将细胞置于冰上的金属板中的培养皿内，用预冷的 PBS²⁺ （PBS [0.2 g/升 KCl、0.2 g/升 KH₂PO₄、8 g/升 NaCl 和 2.17 g/升 Na₂HPO₄·7H₂O]，另加 0.1 g/升 CaCl₂ 和 0.1 g/升 MgCl₂·6H₂O）洗涤细胞一次。随后，在冰上金属板的干净 Parafilm 上滴加 30 μl 可识别目标蛋白胞外域的抗体（本例中为小鼠单克隆抗体 TK1 [IgG₁，由已故 Thomas Kreis 提供]）。将带有细胞的滤膜倒置覆盖于液滴上，并在滤膜背面滴加少量抗体溶液。在冰上孵育 1 小时。
2. 将细胞转移至 12 孔板中，用预冷的 PBS²⁺ 洗涤 3 次（若未进行表面染色，则使用室温 PBS²⁺），随后在室温下用 3% 多聚甲醛固定 15 分钟。
3. 用 PBS²⁺ 洗涤细胞一次，并在 PBS²⁺ 中静置 5 分钟。
4. 在封闭/通透缓冲液（BPB）（含 2% [wt/vol] BSA 和 0.4% [wt/vol] 皂苷的 PBS²⁺）中加入 10% [vol/vol] 山羊血清，将细胞在其中于室温孵育 1 小时。
5. 用 BPB 将用于检测表达的 Rab GTP 酶的一抗稀释至合适浓度（本例中为抗-V5 抗体 [小鼠单克隆抗体 IgG_2a，Invitrogen]，稀释比例为 1:200）。将稀释后的抗体溶液在微量离心机中以 13,000 rpm 离心 10 分钟。取 30 μl 抗体溶液滴加于湿盒内干净的 Parafilm 上。将带有细胞的滤膜倒置覆盖于液滴上，在室温下孵育 1 小时。
6. 将细胞重新正置放回 12 孔板中，在室温下用 BPB 洗涤 5 次，共 30 分钟。
7. 将合适的二抗稀释于 BPB 中（本例中为 Alexa 594 标记的山羊抗小鼠 IgG₁ [用于检测细胞表面 VSVG，Invitrogen]，以及 Cy5 标记的二抗用于检测 Rab GTP 酶，例如 Cy5 标记的山羊抗小鼠 IgG_2a [Jackson ImmunoResearch]，稀释比例为 1:200），按前述方法离心。取 30 μl 抗体溶液滴加于湿盒内干净的 Parafilm 上，将带有细胞的滤膜倒置覆盖于液滴上，在室温下孵育 1 小时。
8. 重复步骤 4.6。
9. 将滤膜上的细胞在去离子水中浸洗 3 次，正置放置于显微载片上。在细胞上方加入 10–15 μl 封片剂（含 10% [wt/vol] DABCO 和 50% [wt/vol] 甘油的蒸馏水溶液）。盖上 18×18 mm 的盖玻片，并用纸巾轻轻按压使其贴合细胞。用指甲油封片。
10. 使用共聚焦显微镜观察样本。本实验使用配备 63× 水镜的 Microsystem LSM 510 显微镜（Carl Zeiss MicroImaging, Inc.）。
11. 图像处理时，使用 Adobe Photoshop 和 Adobe Illustrator 等软件对图像进行调整与合并以制图。

5. 代表性结果

有关小GTP酶共表达如何干扰VSVG分选的示例，请参阅已发表的文章，了解其在顶膜错误分选^{3, 4}或细胞表面递送受抑制⁷中的作用。

图 1。在模拟转染（即仅转染编码 VSVGts045-GFP 的质粒）条件下，通过表面染色（红色，图 1 A）可见，该蛋白被递送至高度极化的 MDCK 细胞的基底外侧表面。需注意，在31°C的追踪过程中，并非全部 VSVGts045-GFP 均被递送至基底外侧膜，这由细胞内总蛋白的强信号（绿色，图 1 A 和 B）所证实。在极化程度不足的细胞中，VSVGts045-GFP 也会被递送至顶膜（图 1 B）。若您的对照样本呈现图 1 B 中细胞的形态，则数据不可靠，必须使用极化程度更高的细胞重复实验。比例尺为 5 μm。

讨论

成功进行显微注射实验最关键的步骤是DNA的质量与纯度以及细胞的极性。若细胞缺乏极性，注射对照组中的VSVG蛋白将已经发生错误定位，导致实验无法使用。如果DNA质量较差，则可能堵塞注射针头，从而导致目标蛋白表达水平低下甚至完全不表达。此外，建议使用已知可实现高水平表达的表达质粒，例如pRKV。

如果需要检测其他货物蛋白的分选情况，可以对温度转换方案进行调整。例如，为了表达低密度脂蛋白受体，我们首先在37°C下进行显微注射，随后在37°C下孵育1小时，接着在20°C下孵育4小时（以将货物蛋白滞留在反式高尔基网络，TGN），最后在37°C下孵育2小时，并加入0.1 mg/ml环己酰亚胺以追踪蛋白向细胞表面的转运。对于某些蛋白（如Fc受体），根据目标货物蛋白合成及经由分泌途径转运的速度，20°C下的孵育时间可缩短至2小时。有关我们针对不同货物蛋白所采用的孵育条件的详细描述，请参见Nokeset al., 2008 ⁷。

最后，该方案不仅可以用于小GTP酶的分析，理论上还可用于所有您怀疑在（极性）...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
带加热载物台的Axiovert 200显微镜	Carl Zeiss, Inc.	定制订单
Injectman NI2 Femtojet显微操作仪	Eppendorf	定制订单
Femtotips II（显微注射针）	Eppendorf	930000043
Microloader吸头	Eppendorf	930001007
透明12 mm transwell滤膜支架	Corning	3460
无内毒素质粒大提试剂盒	Sigma-Aldrich	NA0400