受运动调节神经元的生理学、形态学及神经化学特征分析

摘要

本文描述了一种技术，用于量化哺乳动物神经元在运动过程中的体内生理反应，并将神经元的生理特性与其形态学特征、神经化学表型及突触微环路相关联。

摘要

单个神经元及其在神经回路中的功能对于理解感觉和运动功能的神经机制至关重要。大多数关于感觉运动机制的研究依赖于在动物处于静止状态时对神经元的检测^1,2 或在运动过程中记录神经元的细胞外活动。^3,4 尽管这些研究为感觉运动功能提供了基本的理论基础，但它们要么未能评估运动过程中发生的功能性信息，要么在全面表征神经元的解剖结构、生理特性及神经化学表型方面存在局限性。本文展示了一种可在单个神经元水平上进行广泛表征的技术，该技术能够在运动过程中实现 体内 运动。该技术不仅可用于研究初级传入神经元，还可用于表征运动神经元和感觉运动中间神经元。首先，在下颌进行各种运动的过程中，采用电生理学方法记录单个神经元的反应，随后确定该神经元的感受野。然后将神经示踪剂通过细胞内注射注入该神经元，再对脑组织进行处理，以便通过光学显微镜、电子显微镜或共聚焦显微镜观察该神经元（图1）。接着重建已表征神经元的详细形态，从而将神经元形态与其生理反应相关联（图2，3）。本文介绍了成功实施该技术的重要关键细节和实用技巧。通过将该方法与其他技术结合，可进一步获取所研究神经元的宝贵附加信息。逆行神经元标记可用于确定与标记神经元形成突触的其他神经元，从而详细解析神经环路。免疫细胞化学可与该方法结合，用于检测标记神经元内的神经递质，并确定与其形成突触的神经元的化学表型。标记神经元还可用于电镜样品制备，以分析其超微结构特征及微环路连接。总体而言，该技术是一种在 体内 运动，从而深入了解神经元在感觉运动功能中的作用。

方案

1. 动物准备

1. 用戊巴比妥钠（50 mg/kg，腹腔注射）麻醉大鼠，并将其置于加热垫上。使用动物专用剪刀剃除后颅部皮肤上的毛发。通过夹捏脚趾检查是否存在撤回反射和发声，以及是否存在眼睑反射，以确认动物已达到手术麻醉水平。每15分钟检查一次麻醉深度，并每隔45分钟通过注射戊巴比妥钠（15 mg/kg）维持手术麻醉水平。
2. 采用无菌技术，在腹股沟区域腹部与内侧大腿交界皱褶远端做一切口，将导管（直径1 mm，Clay Adams）插入股静脉和股动脉。在下颌下区域做正中切口，牵开舌骨下肌群。在气管上做一小切口，插入导管（直径2 mm）以实现通气。用缝线将气管导管固定，防止移位。通过动脉导管监测全身舒张压和收缩压。除继续监测撤回反射和眼睑反射外，还需监测血压以评估麻醉水平。必要时通过静脉导管追加麻醉药物。
3. 将大鼠固定于立体定位仪中，进行开颅手术以暴露小脑。将气管导管连接至啮齿类动物呼吸机，使用加湿空气以每分钟100次、每次2 cm³的潮气量进行通气。应维持1 cm H₂O的呼气末正压，以防止肺塌陷。每15分钟对肺部进行一次过度充气，以预防肺不张。随后用预热至30°C的矿物油覆盖脑表面。注意避免位于顶骨与间顶骨连接处正下方的大型静脉窦。
4. 将氰基丙烯酸盐胶水涂于连接电磁振动器的金属杆上，并将该杆固定于下颌门齿间隙。通过计算机A/D输出或信号发生器向振动器发送指令信号，从而驱动下颌运动。
5. 在开颅部位附近的皮下放置一个银-氯化银接地电极。

2. 电极制备

1. 使用水平微电极拉制仪，从石英或铝硅酸盐玻璃中制备微电极。
2. 用含有5-10%生物素酰胺的溶液填充微电极，该溶液溶解于0.25M KCl和0.5M Tris HCl缓冲液（pH 7.6）中，或使用生理盐水（pH 6）中含2%四甲基罗丹明的溶液。使用电极测试仪检测电极阻抗。记录大直径轴突时，制备阻抗为60-80MΩ的电极；记录小轴突和中间神经元时，制备阻抗为80-150MΩ的电极。
3. 将微电极插入电位计的前置放大头阶段。通过固定在动物头部后方的小型望远镜（20倍放大，内置分划板）观察电极。使用望远镜非常重要，因为它能够实现电极的立体定位，具有很高的精确度。

3. 电生理记录与细胞内染色

1. 在软脑膜上制造一个小开口，并过度补偿电容反馈，以便当电极接触大脑时产生反馈信号。这有助于精确定位大脑表面。
2. 通过步进电机反复进行下颌位移并推进电极进入脑组织。
3. 通过直流电位的突然下降识别神经元穿刺，并通过持续的突触活动确认胞内穿刺。使用过度补偿电容的电极“嗡鸣”或轻敲几乎无法成功实现细胞穿刺。由于电极阻抗较高，穿刺前通常难以观察到神经元反应。
4. 穿刺神经元并确认穿刺稳定后，采用斜坡-保持和正弦波下颌运动来表征神经元反应⁵。使用非导电探针（如木棒）探查头面部皮肤及口内腔，以绘制神经元的感受野。若研究相关，可进一步检测神经元对其他功能相关刺激（如肌肉收缩和伤害性刺激）的反应⁶。初级传入伤害性感受神经元受体对伤害性刺激产生反应。像戊巴比妥钠这类全身麻醉剂并不阻断初级传入神经元的轴突传导，而是抑制突触传递，因此初级传入神经元轴突的轴突传导功能得以保留。
5. 注入电流（直流，1–4 nA），总注射时间为15–70 nA·分钟。在电流注射过程中监测电极穿刺状态，若膜电位变得比 –30 mV 更正，则应立即停止注射。

4. 组织处理

1. 通过静脉注射过量戊巴比妥钠（140 mg/kg）处死动物，并用血管冲洗液灌注：先用含500单位肝素和1 ml 2% 利多卡因的0.9% NaCl溶液（38°C），随后用0.1 M磷酸缓冲液（pH 7.4）中的4%多聚甲醛灌注。
2. 取出脑组织，使用振动切片机在冠状面、矢状面或水平面将其切成50–100 μm厚的切片，将切片自由漂浮收集于25°C的PBS中。
3. 进行DAB染色处理：将脑切片在含1–2%正常山羊血清和1% Triton X-100的0.01 M PBS中孵育，随后在亲和素-生物素复合物（1:50 Elite Vectastain）中孵育。使用镍增强DAB与H₂O₂进行反应显色。若进行Texas Red染色，则将切片在PBS中与亲和素-生物素复合物（1:50）4°C孵育过夜，然后在PBST中与4% Texas Red标记的亲和素DCS（avidin DCS）4°C孵育过夜。最后在23°C下用荧光尼氏染料（NeuroTrace）复染切片20分钟。
4. 若神经元已注射罗丹明，则直接使用荧光显微镜（激发波长545 nm）观察注射的神经元。

5. 结合逆行标记、免疫细胞化学、共聚焦成像和定量共定位分析的方法

该技术与其他方法联合使用能否成功，很大程度上取决于良好的细胞内标记。

1. 此处展示的方法可轻松与逆行性神经元标记技术相结合。^7-10 具体操作为：麻醉动物后，采用无菌技术将神经示踪剂（如辣根过氧化物酶（20% 辣根过氧化物酶，Sigma VI，Sigma）和 1% 小麦胚凝集素标记的辣根过氧化物酶（Sigma））注射至外周靶区（例如咬肌）。该神经示踪剂将被外周轴突摄取，并通过轴突运输传递至运动神经元胞体。对于咬肌，使用无菌的 10 微升微量注射器向肌肉内注射 15μl 示踪剂。注射后将动物置于加热垫上，监测直至从麻醉中恢复，随后放回笼中进行恢复。24 小时后，再次麻醉动物，进行神经元的生理学表征并进行细胞内染色。然后按照上述方法灌注动物，并使用四甲基联苯胺（TMB）作为显色剂、钨酸钠作为稳定剂，并辅以钴增强，对组织切片进行 HRP 检测。将切片置于含 1% 钨酸钠的 0.1M PBS（pH 6.5）溶液中，同时加入 0.0007% TMB 溶于无水乙醇和丙酮的混合液中，在 15°C 下孵育 20 分钟。随后，每 100ml 孵育液中加入 1.0 ml 0.3% H₂O₂，反应 60 分钟。用 0.1M PBS（pH 6.5）冲洗组织，再将其置于含 0.05% 二氨基联苯胺（pH 7.4）、0.02% 钴和 0.01% H₂O₂ 的 0.1M PBS（pH 7.4）溶液中，在 37°C 下孵育 10 分钟。按前述方法处理组织以可视化经生物素酰胺注射的神经元，并观察标记的感觉神经元与多种运动神经元之间的关系。
2. 此处展示的技术也可方便地与免疫细胞化学技术结合使用。⁶ 例如，对脑组织进行突触素的免疫细胞化学处理，以精确定位标记神经元内的突触（图 3）。具体操作为：将脑切片在小鼠抗突触素抗体（1:10,000）中于 4°C 孵育 2 天，随后在抗小鼠 FITC 抗体（1:400）中于 23°C 孵育 1 小时。
3. 使用荧光标记物标记或用于荧光成像处理的神经元非常适合共聚焦成像。图 3 是通过共聚焦显微镜获取的轴突终末膨大光学切片示例（图 3）。通过获取标记神经元的多个光学切片，可生成标记神经元的三维动画（图 4）。
4. 采用本方法标记的神经元可用于定量共定位分析。为此，可结合 NIH Image 软件使用公开可用的软件宏（网址：http://phy.ucsf.edu/°idl/colocalization.htm）。通过将细胞内标记与突触素免疫细胞化学相结合，可在单个轴突终末内定位突触素。⁶

6. 代表性结果：

使用该方法可获得的代表性结果概览如图1所示。该脑干单个神经元在下颌运动过程中进行了电生理记录，如图中清晰可见，该神经元的反应（图1左下，浅蓝色）在运动期间发生了调制。在完成电生理特性表征后，该神经元被注入生物胞素（biotinamide），随后进行组织处理以实现可视化。重建后的神经元（图1中部，绿色）可与解剖学标志相对应，此处为三叉神经运动核（以红色轮廓标出）。根据该神经元在运动期间的反应特性及其形态重建结果，可将其鉴定为继发性肌梭传入神经元。图2展示了一个神经元在下颌位移过程中的典型生理反应，神经元反应以瞬时放电频率表示。请注意，该神经元的反应与下颌位移高度一致，表明该神经元提供了与下颌位置相关的感官反馈。图3为经细胞内染色的轴突与突触素（synaptophysin）染色及尼氏染色（Nissl stain）联合成像的高倍放大图像。请注意突触素（黄色）在轴突末梢内的共定位现象。图4为一个经过生理特性鉴定并进行细胞内标记的单个神经元的动画展示。

图1. 方法概述。左上：下颌位移。中：单个神经元（黄色）的细胞内记录（绿色），该神经元的形态在细胞内记录和染料注射后被重建。红色轮廓表示三叉神经运动核的位置。左下：该神经元在下颌运动期间的生理反应。

图2. 单个肌肉感觉神经元记录到的代表性生理反应 体内 下颌运动过程中，注意神经元反应与下颌位移的相似性。

图3. 对肌肉探查有反应的细胞内标记感觉神经元的终末轴突分支及其突触小结（红色膨大）。后续进行的突触素免疫细胞化学染色显示突触素定位于轴突小结内（黄色）。绿色为荧光尼氏染色。

图4. 肌梭初级传入神经元轴突的生理反应记录动画 体内 下颌运动期间，随后对轴突进行细胞内染色并处理以供观察。
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讨论

本文所展示的方法是一种强大的技术，能够深入揭示单个神经元的功能，以及单个神经元的反应如何参与构成神经环路⁹。这些知识对于理解感觉运动功能至关重要。该技术的最大优势在于，能够同时获取关于神经元的多种参数信息，包括生理学特性、形态学特征以及突触的形态与分布。当该方法与其他技术（如逆行神经元标记）结合使用时，还可进一步表征神经元环路等附加信息^7,8。该方法的另一优势是可分步骤学习掌握。例如，可先进行细胞内记录，待熟练掌握基础技术后，再逐步加入细胞内染色、免疫细胞化学或逆行神经元标记等操作。该技术最主要的局限性在于，每次实验中仅能标记少量神经元。通常情况下，最初仅对两到三个具有特定生理特性的神经元进行标记。一旦提出生理特性与形态特征之间潜在关系的假设，后续实验将通过仅标记单个神经元的严谨设计，进一步验证该关系。

该方法成功最关键的步骤是保持细胞内电生理记录的稳定性。记录稳定性会因所研究神经元在脑内的位置不同而有很大差异，但可通过多种操作来提高记录稳定性。可进行气胸手术并对动物实施人工通气，以减少呼吸波动的影响。通过施加约1 cm H_2<...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
电磁振动器	Ling Dynamic Systems	V101
信号发生器	Feedback Systems	PFG605	能够产生梯形输出信号
电极玻璃管	Sutter Instrument Co.	AF100-68-10	带灯丝
电极拉制仪	Sutter Instrument Co.	Model P-2000 或 P-80
生物素酰胺	Vector Laboratories	SP-1120	储存于 4°C
德克萨斯红链霉亲和素 DCS	Vector Laboratories	A-2016
四甲基罗丹明	Molecular Probes, Life Technologies	D-3308	分子量 3000，可与赖氨酸交联固定
小鼠抗突触素抗体	Chemicon International	MAB5258
荧光尼氏染色剂	Neurotrace, Life Technologies	N-21480
电极测试仪	Winston Electronics	BL-1000-B	用于测量电极阻抗
电位计	Axon Instruments	Axoprobe 1A, Axoclamp 2B