本文描述了一种技术，用于量化哺乳动物神经元在运动过程中的体内生理反应，并将神经元的生理特性与其形态学特征、神经化学表型及突触微环路相关联。
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本文内容
摘要
摘要
单个神经元及其在神经回路中的功能对于理解感觉和运动功能的神经机制至关重要。大多数关于感觉运动机制的研究依赖于在动物处于静止状态时对神经元的检测1,2 或在运动过程中记录神经元的细胞外活动。3,4 尽管这些研究为感觉运动功能提供了基本的理论基础，但它们要么未能评估运动过程中发生的功能性信息，要么在全面表征神经元的解剖结构、生理特性及神经化学表型方面存在局限性。本文展示了一种可在单个神经元水平上进行广泛表征的技术，该技术能够在运动过程中实现 体内 运动。该技术不仅可用于研究初级传入神经元，还可用于表征运动神经元和感觉运动中间神经元。首先，在下颌进行各种运动的过程中，采用电生理学方法记录单个神经元的反应，随后确定该神经元的感受野。然后将神经示踪剂通过细胞内注射注入该神经元，再对脑组织进行处理，以便通过光学显微镜、电子显微镜或共聚焦显微镜观察该神经元（图1）。接着重建已表征神经元的详细形态，从而将神经元形态与其生理反应相关联（图2，3）。本文介绍了成功实施该技术的重要关键细节和实用技巧。通过将该方法与其他技术结合，可进一步获取所研究神经元的宝贵附加信息。逆行神经元标记可用于确定与标记神经元形成突触的其他神经元，从而详细解析神经环路。免疫细胞化学可与该方法结合，用于检测标记神经元内的神经递质，并确定与其形成突触的神经元的化学表型。标记神经元还可用于电镜样品制备，以分析其超微结构特征及微环路连接。总体而言，该技术是一种在 体内 运动，从而深入了解神经元在感觉运动功能中的作用。
方案
1. 动物准备
- 用戊巴比妥钠（50 mg/kg，腹腔注射）麻醉大鼠，并将其置于加热垫上。使用动物专用剪刀剃除后颅部皮肤上的毛发。通过夹捏脚趾检查是否存在撤回反射和发声，以及是否存在眼睑反射，以确认动物已达到手术麻醉水平。每15分钟检查一次麻醉深度，并每隔45分钟通过注射戊巴比妥钠（15 mg/kg）维持手术麻醉水平。
- 采用无菌技术，在腹股沟区域腹壁与内侧大腿交界皱褶远端做一切口，将导管（直径1 mm，Clay Adams）插入股静脉和股动脉。在下颌下区域做一正中切口，牵开舌骨下肌群。在气管上做一小切口，插入导管（直径2 mm）以实现通气。用缝线围绕气管导管结扎固定。通过动脉导管监测全身舒张压和收缩压。除监测撤回反射和眼睑反射外，还需监测血压以评估麻醉水平。必要时通过静脉导管追加麻醉药物。
- 将大鼠固定于立体定位仪中，进行开颅手术暴露小脑。将气管导管连接至啮齿类动物呼吸机，使用加湿空气以每次2 cm3、频率100次/分钟进行通气。应维持1 cm H2O的呼气末正压，以防止肺塌陷。每15分钟进行一次肺部过度充气，预防肺不张。随后用温热的矿物油（30°C）覆盖脑表面。注意避免位于顶骨与间顶骨连接处正下方的大静脉窦。
- 将氰基丙烯酸盐胶水涂于连接电磁振动器的金属杆上，并将该杆固定于下颌门齿间隙。通过计算机A/D输出或信号发生器发出的指令信号控制振动器移动下颌。
- 在开颅部位附近的皮下放置一个银-氯化银接地电极。
2. 电极制备
- 使用水平微电极拉制仪，从石英或铝硅酸盐玻璃中制备微电极。
- 用含有5-10%生物素酰胺的溶液填充微电极，该溶液溶解于0.25M KCl和0.5M Tris HCl缓冲液（pH 7.6）中，或使用生理盐水（pH 6）中含2%四甲基罗丹明的溶液。使用电极测试仪检测电极阻抗。记录大直径轴突时，制备阻抗为60-80MΩ的电极；记录小轴突和中间神经元时，制备阻抗为80-150MΩ的电极。
- 将微电极插入电位计的前置放大器头部。通过固定在动物头部后方的小型望远镜（20倍放大，内置分划板）观察电极。使用望远镜非常重要，因为它能够实现电极的立体定位，具有很高的精确度。
3. 电生理记录与细胞内染色
- 在软脑膜上制造一个小开口，并过度补偿电容反馈，以便当电极接触脑组织时产生反馈信号。这有助于精确定位脑表面位置。
- 通过步进电机反复进行下颌位移并推进电极进入脑内。
- 通过直流电位的突然下降识别神经元穿刺，并根据持续的突触活动判断是否进入胞体内。使用电容过度补偿或轻敲电极产生“嗡鸣”通常难以成功穿入细胞。由于电极阻抗较高，在穿刺前通常难以观察到神经元反应。
- 穿刺到神经元并确认穿刺稳定后，采用斜坡-保持和正弦波下颌运动来表征神经元反应5。使用非导电探针（如木棒）探查头面部皮肤及口内腔，以绘制神经元的感受野。若研究需要，还可检测神经元对其他功能相关刺激（如肌肉收缩和伤害性刺激）的反应6。初级传入伤害性感受神经元受体对伤害性刺激产生反应。像戊巴比妥钠这类全身麻醉剂并不阻断初级传入神经元的轴突传导，而是抑制突触传递，因此初级传入神经元轴突的传导功能得以保留。
- 注入电流（直流，1–4 nA），总注射时间持续15–70 nA·分钟。在电流注射过程中监测电极穿刺状态，若膜电位变得比 –30 mV 更正，则应立即停止注射。
4. 组织处理
- 通过静脉注射过量戊巴比妥钠（140 mg/kg）处死动物，并用血管冲洗液灌注：先用含500单位肝素和1 ml 2% 利多卡因的0.9% NaCl溶液（38°C），随后用0.1 M磷酸缓冲液（pH 7.4）中的4%多聚甲醛溶液灌注。
- 取出脑组织，使用振动切片机在冠状面、矢状面或水平面将其切成50–100 μm厚的切片，将切片自由漂浮收集于25°C的PBS中。
- 进行DAB显色处理：将脑切片在含1–2%正常山羊血清和1% Triton X-100的0.01 M PBS中孵育，随后在亲和素-生物素复合物（1:50 Elite Vectastain）中孵育。使用镍增强DAB与H2O2进行反应显色。若进行Texas Red荧光标记处理，则将切片在PBS中与亲和素-生物素复合物（1:50）4°C孵育过夜，然后在PBST中与4% Texas Red标记的亲和素DCS（avidin DCS）4°C孵育过夜。最后用荧光尼氏染料（NeuroTrace）在23°C对切片进行20分钟的复染。
- 若神经元已注射罗丹明，可直接使用荧光显微镜（激发波长545 nm）观察注射的神经元。
5. 结合逆行标记、免疫细胞化学、共聚焦成像和定量共定位分析的方法
该技术与其他方法联合应用的成功与否，在很大程度上取决于良好的细胞内标记效果。
- 此处展示的方法可轻松与逆行性神经元标记技术相结合。7-10 为此，先将动物麻醉，然后采用无菌技术，将神经示踪剂（如20%辣根过氧化物酶（Sigma VI，Sigma）和1%麦芽凝集素标记的辣根过氧化物酶（Sigma））注射至外周靶区，例如咬肌。该神经示踪剂将被外周轴突摄取，并通过轴突运输传递至运动神经元胞体。对于咬肌， 15μl 使用无菌的10微升微量注射器将示踪剂注入肌肉。随后将动物置于加热垫上，监测直至从麻醉中恢复，然后放回笼中继续恢复。24小时后，对动物实施麻醉，进行神经元的生理学表征并进行细胞内染色。接着按照上述方法灌注动物，并使用四甲基联苯胺（TMB）作为显色剂、钨酸钠作为稳定剂，并辅以钴增强的方法对组织切片进行HRP检测。将切片置于含1%钨酸钠的0.1 M PBS（pH 6.5）溶液中，以及含0.0007% TMB的无水乙醇与丙酮混合液中 15°C 20分钟。然后通过加入1.0 ml 0.3% H₂O₂溶液，对组织切片进行反应。2O2 每100 ml孵育液孵育60分钟。用0.1 M PBS（pH 6.5）冲洗组织，然后置于含0.05%二氨基联苯胺（pH 7.4）、0.02%钴和0.01% H₂O₂的溶液中2O2 在0.1 M PBS（pH 7.4）中孵育10分钟。 37°C将组织进行处理，以观察被生物胞素标记的神经元，并按照所述方法可视化标记的感觉神经元与多种运动神经元之间的关系。
- 此处展示的技术也可轻松地与免疫细胞化学相结合。6 例如，对脑组织进行突触素的免疫细胞化学处理，以准确定位标记神经元内的突触图 3）。为此，将脑切片在小鼠抗突触素抗体（1:10,000）中孵育2天，置于 4°C 然后在抗小鼠 FITC（1:400）中孵育 1 小时 23°C.
- 使用荧光标记物标记或经荧光成像处理的神经元适用于共聚焦成像。图3是通过共聚焦显微镜获取的轴突末梢光学切片示例。图 3）。通过获取标记神经元的多个光学切片，生成标记神经元的动画图 4).
- 使用该方法标记的神经元可用于定量共定位分析。为此，可结合使用美国国立卫生研究院（NIH）Image 软件及公开可用的软件宏（见 http://phy.ucsf.edu/）°idl/colocalization.htm）。通过将细胞内标记与突触素免疫细胞化学相结合，实现单个轴突末梢内突触素的定位。6
6. 代表性结果：
使用该方法可获得的代表性结果概述见图1。该脑干神经元在下颌运动过程中进行了电生理记录，如图所示，该神经元的反应（图1左下角，浅蓝色）在运动期间受到调制。在完成电生理特性表征后，该神经元被注入生物胞素（biotinamide），并进一步处理以实现可视化。重建后的神经元（图1中部，绿色）可与解剖学标志相对照，本例中为三叉神经运动核（以红色轮廓标出）。根据该神经元在运动过程中的反应特性及其形态重建结果，可将其鉴定为二级肌梭传入神经元。图2展示了一个神经元在下颌位移过程中的典型生理反应示例。神经元反应以瞬时放电频率表示。请注意，该神经元的反应与下颌位移高度一致，表明该神经元提供与下颌位置相关的感觉反馈信息。图3为经细胞内染色的轴突与突触素（synaptophysin）染色及尼氏染色（Nissl stain）联合成像的高倍放大图像。请注意突触素（黄色）在轴突终扣内的共定位现象。图4为单个经电生理特性表征并进行细胞内标记的神经元的动画演示。
图1. 方法概述。左上方：下颌位移。中图：单个神经元（黄色）的细胞内记录（绿色）。该神经元的形态在细胞内记录和染料注射后被重建。红色轮廓表示三叉神经运动核的位置。左下方：该神经元在下颌运动期间的生理反应。
图2. 单个肌肉感觉神经元记录的代表性生理反应 在体 下颌运动过程中，注意神经元反应与下颌位移的相似性。
图3. 细胞内标记的感觉神经元终末轴突分支及其在肌组织探查过程中产生反应的突触小泡（红色膨大结构）。随后进行的突触素免疫细胞化学染色显示突触素定位于轴突小泡内（黄色）。绿色为荧光尼氏染色。
图4. 肌梭初级传入神经元轴突的生理反应记录动画 体内 下颌运动期间，轴突随后进行细胞内染色并处理以供观察。
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讨论
本文所展示的方法是一种强大的技术，能够深入揭示单个神经元的功能，以及单个神经元的反应如何参与构成神经环路9。这些知识对于理解感觉运动功能至关重要。该技术的最大优势在于，能够同时获取关于神经元的多种参数信息，包括生理学特性、形态学特征以及突触的形态与分布。当该方法与其他技术（如逆行神经元标记）结合使用时，还可进一步表征神经元环路等附加信息7,8。该方法的另一优势是可分步骤学习掌握。例如，可先进行细胞内记录，待熟练掌握基础技术后，再逐步加入细胞内染色、免疫细胞化学或逆行神经元标记等操作。该技术最主要的局限性在于，每次实验中仅能标记少量神经元。通常情况下，最初仅对两到三个具有特定生理特性的神经元进行标记。一旦提出生理特性与形态特征之间潜在关系的假设，后续实验将通过仅标记单个神经元的严谨设计，进一步验证该关系。
该方法成功最关键的步骤是保持细胞内电生理记录的稳定性。记录稳定性会因所研究神经元在脑内的位置不同而有很大差异，但可通过多种操作来提高记录稳定性。可进行气胸手术并对动物实施人工通气，以减少呼吸波动的影响。通过施加约1 cm H2<...
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披露
动物实验严格按照《实验动物护理和使用指南》（NIH出版物第86-23号，1985年修订版）以及马里兰大学动物护理和使用委员会的规定进行。
致谢
感谢 Anthony Taylor 在 体内 细胞内记录技术方面的初期培训，感谢 A. Brown 和 David Maxwell 在细胞内染色技术初期开发过程中提供的帮助。感谢 M. Silver 在共定位宏程序方面提供的协助。许多与我合作过的学者为本技术的发展提供了宝贵见解，包括 R. Donga、M. Moritani、P. Luo 和 R. Ambalavanar。本技术的开发得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金项目 DE10132、DE15386 和 RR017971 的大力支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 电磁振动器 | Ling Dynamic Systems | V101 | |
| 信号发生器 | Feedback Systems | PFG605 | 能够产生梯形输出信号 |
| 电极玻璃管 | Sutter Instrument Co. | AF100-68-10 | 带灯丝 |
| 电极拉制仪 | Sutter Instrument Co. | Model P-2000 或 P-80 | |
| 生物素酰胺 | Vector Laboratories | SP-1120 | 储存于 4°C |
| 德克萨斯红链霉亲和素 DCS | Vector Laboratories | A-2016 | |
| 四甲基罗丹明 | Molecular Probes, Life Technologies | D-3308 | 分子量 3000，可与赖氨酸交联固定 |
| 小鼠抗突触素抗体 | Chemicon International | MAB5258 | |
| 荧光尼氏染色剂 | Neurotrace, Life Technologies | N-21480 | |
| 电极测试仪 | Winston Electronics | BL-1000-B | 用于测量电极阻抗 |
| 电位计 | Axon Instruments | Axoprobe 1A, Axoclamp 2B |
参考文献
- Cuellar, C. A., Tapia, J. A., Juarez, V., Quevedo, J., Linares, P., Marinez, L., Manjarrez, E. Propagation of sinusoidal electrical waves along the spinal cord during a fictive motor task. J. Neurosci. 29, 798-810 (2010).
- Frigon, A., Gossard, J. Evidence for specialized rhythm-generating mechanisms in the adult mammalian spinal cord. J. Neurosci. 30, 7061-7071 (2010).
- Wang, W., Chan, S. S., Heldman, D. A., Moran, D. W. Motor cortical representation of hand translation and rotation during reaching. J. Neurosci. 30, 958-962 (2010).
- Ma, C., He, J. A method for investigating cortical control of stand and squat in conscious behavioral monkeys. J. Neurosci. Meth. 192, 1-6 (2010).
- Dessem, D., Donga, R., Luo, P. Primary- and secondary-like jaw-muscle spindle afferents have characteristic topographic distributions. J. Neurophysiol. 77, 2925-2944 (1997).
- Dessem, D., Moritaini, A., Ambalavanar, R. Nociceptive craniofacial muscle primary afferent neurons synapse in both the rostral and caudal brain stem. J. Neurophysiol. 98, 214-223 (2007).
- Luo, P., Dessem, D. Inputs from identified jaw-muscle spindle afferents to trigeminothalamic neurons in the rat: a double-labeling study using retrograde HRP and intracellular. J. Comp. Neurol. 353, 50-66 (1995).
- Dessem, D., Luo, P. Jaw-muscle spindle afferent feedback to the cervical spinal cord in the rat. J. Comp. Neurol. 128, 451-459 (1999).
- Luo, P., Wong, R., Dessem, D. Projection of jaw-muscle spindle afferents to the caudal brainstem in rats demonstrated using intracellular biotinamide. J. Comp. Neurol. 358, 63-78 (1995).
- Luo, P., Dessem, D. Ultrastructural anatomy of physiologically identified jaw-muscle spindle afferent terminations onto retrogradely labeled jaw-elevator motoneurons in the rat. J. Comp. Neurol. 406, 384-401 (1999).
- Hassani, O. K., Henny, P., Lee, M. G., Jones, B. E. GABAergic neurons intermingled with orexin and MCH neurons in the lateral hypothalamus discharge maximally during sleep. Eur. J. Neurosci. 32, 448-457 (2010).
- Inokawa, H., Yamada, H., Matsumoto, N., Muranishi, M., Kimura, M. Juxtacellular labeling of tonically active neurons and phasically active neurons in the rat striatum. Neuroscience. 168, 395-404 (2010).
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