哥廷根小型猪的基本外科技术：插管、膀胱导管插入、股血管导管插入及经心灌注

摘要

近年来，家猪和小型猪在科学研究中的应用显著增加。通过演示气管插管、经尿道膀胱导管插入、股动脉和股静脉导管插入以及经心灌注等操作方法，我们旨在进一步提升哥廷根小型猪在生物医学研究中的价值。

摘要

哥廷根小型猪在神经科学、毒理学、糖尿病、肥胖症以及实验外科等研究领域的应用日益增多，这反映了该动物在解剖学和生理学上与人类的高度相似性^1-6。哥廷根小型猪的体型允许使用与人类相似的外科器械和先进成像技术^6-8。本教学视频旨在通过演示气管插管、经尿道膀胱导尿、股动脉和股静脉插管以及经心灌注等操作，提高科研人员对小型猪在生物医学研究中价值的认识。

气管插管应在小型猪接受全身麻醉时进行，因为该操作可维持气道通畅，允许辅助通气，并防止分泌物误吸入气道。经尿道膀胱插管可在长时间手术过程中提供有关水合状态以及肾功能和心血管功能的重要信息。此外，导尿可避免精密医疗技术设备受到污染，并防止膀胱过度膨胀，后者可能对动物造成伤害，并因迷走张力升高及生理参数改变而对实验结果产生不必要的干扰。动脉和静脉插管有助于反复采集血样并监测多种生理参数。在涉及基于框架的立体定向神经外科手术和脑成像的实验中，股血管插管相较于颈部血管插管更易于操作和接近。在开展需动物存活的实验时，血管插管操作必须严格遵循无菌技术，以防止感染。⁶经心灌注是最有效的固定方法，在制备用于组织学和组织化学研究的迷你猪器官时，可获得极佳的效果^2,9有关猪类麻醉、手术及实验技术的更多信息，可参考 Swindle 2007。有关哥廷根小型猪的术前用药、麻醉诱导、辅助通气、镇痛以及术前和术后护理的补充信息，可通过互联网获取，网址为 http://www.minipigs.com¹⁰有关猪解剖学的详细信息，我们参考 Nickel 的著作 等第1-5卷¹¹.

方案

1. 插管

1. 气管插管所需设备：辅助通气装置、开口拉带、带钝头的低压吸引器、带有17至25 cm长直叶片的兽用喉镜、导丝、装有空气的注射器、听诊器和胶带。对于成年哥廷根小型猪，适用的气管插管尺寸为5至7 mm¹⁰。本视频中使用了5.5 mm的导管¹⁰。
2. 将小型猪仰卧放置，并妥善支撑，以确保喉部通道保持直线。
3. 由助手轻轻拉出舌头并固定张开下颌，避免过度伸展头部。气道旋转或头部过度后仰可能导致气道阻塞，使喉部开口更难识别，并增加导管进入气管的难度。
4. 将喉镜插入咽腔，用于下压舌头，使会厌可见。使用吸引管尖端将会厌从软腭处移开，然后用喉镜尖端将会厌向上推至舌根部，从而暴露喉部开口。
5. 当杓状软骨和声带清晰可见时，在呼气期间轻柔地稍加旋转推进气管插管进入气管。
6. 根据制造商说明为导管气囊充气，注意避免过度充气，以免引起气道肿胀和水肿。猪有一支支气管专门通向右侧前肺叶，因此必须将导管置于气管分叉上方。使用合适尺寸的导管，并通过胶带将导管近端固定在吻部水平，有助于实现正确位置。
7. 当小型猪成功完成插管后，应能通过导管感受到通畅的气流，听诊胸部时可在左右两侧胸壁均听到呼吸音。
8. 将呼吸机监测系统连接至小型猪后，应可测得生理范围内的呼气末二氧化碳值，并可观察到与呼吸机设定参数一致的、随呼吸节律变化的二氧化碳波形^6,10。
9. 二氧化碳和血氧饱和度数值在初期可能受术前用药和麻醉诱导的影响，但在适当通气后应迅速恢复至正常水平^6,10。即使实施人工辅助通气仍出现发绀迹象，提示导管位置不当，最常见的错误是误将导管插入食管。

2. 经尿道膀胱导尿术

1. 此操作仅适用于雌性猪。对于成年小型猪，宜选用8或10号弗利导尿管。由于尿道外口存在弯曲且尺寸较小，建议使用带导丝的导尿管。小型小型猪可使用鼻窥器，而体型较大的动物则可选用叶片较长的窥器。所需设备还包括钝头镊子、盛有生理盐水的注射器、润滑剂以及密闭式尿液引流袋。
2. 为在导尿过程中清晰观察尿道外口，应将小型猪仰卧放置，腰部下方垫一支撑物，同时由助手将后肢向前牵拉。
3. 插入润滑后的窥器并张开，以暴露阴道壁。雌性动物的尿道外口位于阴道底部，距阴道口至宫颈距离的约三分之一至二分之一处（图1A）。但由于动物处于仰卧位，尿道外口的位置看起来呈倒置状态。
4. 使用钝头镊子控制导尿管，使导尿管尖端与镊子保持同一直线。小心地将导尿管插入尿道开口（^图1B）。若导尿过程中施力过大，尿道极易受到损伤。然而，导尿管通过尿道外括约肌时，最初可能会遇到轻微阻力。若阻力持续存在，可能提示动物镇静深度不足，此时应等待一段时间，使麻醉药物充分发挥作用。
5. 当导尿管进入膀胱时，取出导丝，可见尿液流出。
6. 根据制造商说明，用生理盐水充盈导尿管球囊，然后轻柔地向外牵拉导尿管，直至球囊卡在膀胱颈部。
7. 连接密闭式尿液引流袋。
8. 用胶带将导尿管固定于尾部，以防止在操作动物时导尿管意外移位。

3. 股动脉和股静脉插管

1. 所需设备包括：手术刀、钝头手术剪、组织镊、小型钝头手术镊、小型自持式组织牵开器、持针器、手术棉签、带针缝线、用于冲洗以维持导管通畅的肝素化生理盐水、两根18号静脉留置针、两根带导引器和Seldinger导丝的4-French导引鞘。
2. 在开始操作前，应通过检测趾间痛觉反射来评估麻醉深度。
3. 将小型猪仰卧位放置，并将后肢向外侧牵拉，以暴露股动脉和股静脉。在缝匠肌与股薄肌之间的皮肤皱褶处，识别内侧隐动脉浅表部分搏动消失的位置。
4. 在此点头侧做一纵向浅表皮肤切口，以避免意外损伤内侧隐血管。
5. 使用钝头剪刀分离皮下组织。
6. 在内侧隐血管穿入点头侧，先用小型钝头手术镊，再以手指分离缝匠肌与股薄肌的筋膜层。
7. 使用小型自持式组织牵开器分离两组肌肉，同时注意避免损伤股神经及血管。
8. 通过钝性分离，游离股动脉约1至2厘米长度。
9. 旋转斜面静脉留置针，使管腔朝向上方。轻微弯曲针体，以便更易顺应血管走行。注意确保针芯仍可轻松前后移动。
10. 穿刺动脉后退出针芯，通过静脉留置针导管插入Seldinger导丝。
11. 在轻柔压迫动脉以固定导丝的同时，移除静脉留置针导管。
12. 将带导引器的导引鞘沿Seldinger导丝置入，并推进至目标位置，随后移除导引器和Seldinger导丝。
13. 股静脉位于动脉的稍下方和内侧。在通过钝性分离游离静脉后，按照前述动脉插管的方法进行静脉插管。
14. 为确认动脉和静脉导管位置正确，应从两个导引鞘中抽取血液样本，并比较其颜色。每次采血后，务必用肝素化生理盐水冲洗导管，以维持导管通畅。
15. 固定导管后，用数针缝线关闭皮肤切口。
16. 可在动脉和静脉周围放置血管环，以在穿刺前固定血管。尽管该方法具有一定优势，但我们通常避免进行此额外步骤，因其需要过度解剖血管，可能增加损伤外侧支和深支的风险。

4. 经心灌注

1. 进行该操作需要以下设备：灌注系统（图2）、相应的灌注液、手术刀、钝头手术剪、骨剪，以及两把大型自持式止血钳，其中至少一把应具有弯曲的尖端。自持式胸骨牵开器并非绝对必要，但可显著简化操作过程。
2. 经心灌注必须在通风良好的房间内进行，并配备高效排风系统，且具备收集灌注液和血液的设施，以便后续安全处理。
3. 静脉注射致死剂量的戊巴比妥后，在继续操作前应检测趾间疼痛反射。
4. 通过胸骨正中切开术可获得对心脏和主动脉的最佳通路。从胸骨柄开始，沿纵轴做一深部皮肤切口，延伸至剑突。在剑突下方的膈肌处做一小切口，以进入胸腔。
5. 将骨剪插入胸腔，并沿中线切开胸骨。操作时需格外小心，因为心脏可能在某些部位与胸骨内壁粘连。因此，务必确保骨剪的刀片始终位于胸腔内，并紧贴胸骨内侧。
6. 胸骨切开后，置入自持式胸骨牵开器，打开胸腔。
7. 若心包仍完整，可在心尖处做一小切口，然后用手指钝性分离，打开心包囊。
8. 辨认左心室、右心耳、主动脉以及上腔静脉（图1C）。
9. 在心尖附近做一浅表小切口，使用钝头器械穿刺心肌，进入左心室。
10. 将灌注导管插入左心室内，并将导管尖端向头侧推进至主动脉。
11. 当在主动脉内用手触摸到导管时，使用自持式弯曲止血钳将导管固定到位。
12. 切开右心耳，开始通过灌注导管注入固定液。可感觉到灌注液在主动脉内的流动，随着灌注液持续进入小猪血管，血液将从切开的右心耳流出。注意，使用多聚甲醛进行全身灌注时，由于醛类交联作用影响神经和肌肉，可引起肢体强直性伸展及浅层肌肉抽搐。若使用压缩空气驱动而非重力驱动的灌注系统，应在储液罐排空前及时移除导管或夹闭透明硅胶管，以避免空气进入循环系统。

图1. A： 雌性哥廷根小型猪的尿道外口。B： 插入导管后的尿道开口。C： 正中胸骨切开术后小型猪心脏的腹侧观。

图2. A： 灌注系统由带可调压力阀的进液管路和一个用于控制压缩空气进入盛有灌注液容器的杠杆组成。透明硅胶管将容器连接至由一段4 mm钢管制备而成的钝端套管。B 和 C：按压进气口杠杆时，容器内压力上升，推动灌注液流经套管。D：当透明硅胶管路和套管充满灌注液后，使用夹子停止液体流动，系统即准备就绪，可供使用。

讨论

本演示提供了在小型猪研究中常用的四种实验操作的逐步可视化指导^12,13。所述技术在长白猪及其他大型实验动物（如犬和绵羊）中应用时，通常无需或仅需少量调整即可适用¹⁴。在进行可存活模型实验操作时，必须采用无菌技术以防止感染。

麻醉诱导对于动物福利和科学研究均具有重要意义，应在尝试气管插管前确保角膜反射消失以及良好的肌肉松弛。然而，由于诱导麻醉所使用的麻醉药物并非采用固定剂量，而是根据观察到的效应逐步给药，因此必须密切监测动物状态，以防发生呼吸暂停，尤其是在使用丙泊酚时尤为需要注意^6,10。进行气管插管时，可使用利多卡因喷雾或肌肉松弛剂以利于导管置入，但神经肌肉阻滞剂的使用仅限于经过相关操作充分培训的人员操作，以符合伦理要求。插管过程中应避免损伤喉部通道，防止引发气管肿胀和水肿。气道水肿可使用非甾体抗炎药（NSAID）或其他类似抗炎药物治疗¹⁰。猪可在多种体位下进行插管，但仰卧位对于经常进行人类插管操作的人员而言通常更为方便，因为该体位下气道的解剖呈现方式较为相似⁶。插管过程中最常见的错误是误将导管插入食管，当动物处于仰卧位时，食管位于喉部通道正下方。请注意，必须首先清晰辨认杓状软骨和声带，方可推进导管。

通过尿道进行膀胱经尿道导尿在雌性猪中较易操作，而在雄性猪中该操作极为困难，甚至可能无法完成⁶。需要注意的是，由于雌性猪的尿道口位于阴道前方，因此可能误将导管插入较大的阴道开口。在存活实验中，建议使用无菌且具有消毒作用的润滑剂。此外，含有局部麻醉效果的润滑剂可能有助于减轻导尿过程中的困难。

在进行股动脉和股静脉插管时，非存活实验与存活实验所选用的导管类型及其固定方式有所不同，尤其是在导管需要长期植入的情况下⁶。例如，用于慢性植入的导管应具有高度生物相容性，配备用于固定的滞留珠或套袖结构，并且在长期使用过程中不会对血管壁造成损伤，从而避免诱发血栓形成或血管侵蚀⁶。

在本视频中，我们使用由压缩空气驱动的封闭系统进行心脏灌流。另一种选择是使用重力驱动的系统。与使用压缩空气的系统相比，重力系统的优点在于结构简单、效率高，且不存在加压空气进入血管系统的风险。然而，重力系统在灌流过程中产生的静水压会持续变化，这可能会影响组织学结果¹⁵。根据所要进行的组织病理学研究类型，可先用含肝素的生理盐水灌流动物，这可能具有优势。这一点在进行免疫荧光染色时尤为重要，可避免红细胞引起的自发荧光问题。此外，如果目标器官是脑，可夹闭降主动脉以节省固定液。但在猪中，这一步骤需要额外的解剖操作，会延长整个操作时间。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
插管
呼吸机	GE Healthcare	1009-9002-000
钝头吸痰管	Unomedical	34091181
喉镜	Miller	85-0045（喉镜套装）
内径5.5 mm气管插管	Smiths Medical	100/199/055
导丝	Hudson RCI	5-151001
5 ml注射器
听诊器	Martin	17-262-00
膀胱导尿
含导丝的AquaFlate甘油硅胶导尿管（8-French）	Rüsch	178003
鼻窥器	Martin	36-859-50
直肠窥器	Martin	30-613-15
钝头镊子	Martin	13-374-16
导管润滑凝胶
Cathejell Lidocain	Montavit	CJL08501
Instillagel Comb.	Falcon BD	08-40-200
A4尿液引流袋	Unomedical	38 155 1S
胶带
股动脉和股静脉导管插入
手术刀	Martin	10-295-11
钝头手术剪	Martin	11-881-18
组织镊	Martin	12-100-14
小型钝头手术镊	Martin	13-375-13
小型自持式组织牵开器	Martin	15-753-13
持针器	Martin	20-634-14
手术棉片
带针缝线
生理盐水
肝素	Leo Laboratories	585679
18G静脉留置针	BD Biosciences	393206
带导入器和Seldinger导丝的4-French导引鞘	Cordis	154-2629-1/0017
经心灌注
加压灌注系统	自制
排烟系统	Gram A/S	01750000 和 0303700
灌注液 5L
钝头手术剪	Martin	11-881-18
骨剪	F.S.T.	16150-24
大型弯头自持式钳	Martin	13-421-18
自持式胸骨牵开器	Rudolf Medical	7520-10
戊巴比妥	丹麦皇家兽医与农业大学（KVL）	200 mg/ml
22G静脉留置针	BD Biosciences	393202