由于靶细胞纯度的限制，目前用于测量自然杀伤细胞对 HIV 感染细胞裂解反应的细胞毒试验存在局限性。本文通过利用 HIV-1 能够下调 CD4 表达的特性，展示了分离出高纯度的 HIV-1 感染初级 T 细胞母细胞群体的方法。
本文内容
摘要
摘要
自然杀伤细胞（NK细胞）是先天免疫系统应对病毒感染细胞的重要组成部分。了解NK细胞识别和裂解HIV-1感染细胞的能力至关重要，因为发现NK细胞在应对HIV感染细胞时的任何功能异常，都可能为增强其细胞溶解活性的治疗策略提供依据。在细胞毒性实验中，有必要使用HIV感染的原代T细胞母细胞作为靶细胞，而非感染的T细胞系。T细胞系即使未被感染，也极易被NK细胞裂解。此外，必须使用自体原代细胞，以避免靶细胞与效应细胞之间主要组织相容性复合体I类分子（MHC I）不匹配而导致的非特异性裂解。早期评估NK细胞对原代HIV感染细胞细胞溶解反应的研究未能显示出对感染细胞的显著杀伤作用1,2。然而，由于HIV-1感染的原代T细胞中常混有未感染细胞，将这类细胞用于NK细胞功能实验存在困难3。这种感染细胞与未感染细胞比例的不一致，会导致不同样本间NK细胞杀伤活性的差异，而该差异可能并非源于供体NK细胞功能本身的变异。因此，若能获得纯化的感染细胞群体，将有助于在不同实验间标准化效应细胞与靶细胞的比例3,4。本文展示了如何利用HIV-1能够下调感染细胞表面CD4分子的特性，以及商用试剂盒对死亡或濒死细胞的清除能力，从而分离出高度纯化的HIV-1感染细胞群体3-6。纯化后的HIV-1感染原代T细胞母细胞可作为靶细胞，用于以纯化NK细胞为效应细胞的脱颗粒实验或细胞毒性实验5-7。在脱颗粒实验中，以NK细胞作为效应细胞，可评估其释放特异性溶酶体中裂解物质的能力8，这些溶酶体被称为“细胞溶解性颗粒”。通过使用荧光染料标记的抗CD107a抗体进行染色——CD107a是一种溶酶体膜蛋白，当细胞溶解性颗粒与细胞膜融合时会暴露于NK细胞表面——我们可以测定在识别靶细胞后发生脱颗粒的NK细胞所占的百分比。另一种方法是通过细胞毒性实验评估NK细胞的裂解活性，该实验通过检测在NK细胞存在下，靶细胞内51Cr的释放量，来确定被裂解的靶细胞百分比。
方案
1. 从外周血中分离人 CD4+ T 细胞（见图1）
- 采集外周静脉血（40 至 60 mL）至真空采血管中 含钠肝素的试管（Becton Dickinson).
- 外周血随后从真空采血管中转移 将试管转移至50 mL聚苯乙烯圆锥形管（每管20 mL血液）。
- RosetteSep CD4+ T细胞分离试剂（StemCell Technologies) 在50 ml离心管中加入1 mL体积至多20 mL血液中，充分混匀。
- 将混合物在20-25°C 20分钟。
- 20分钟后，使用无钙无镁的磷酸盐缓冲液 [PBS (CMF)]HyClone] 含2%热灭活的（56°C 30分钟）胎牛血清 [FBS（HyClone)] 加入混合物中，以达到 40 mL 的终体积。
- 将稀释后的混合液（30 ml）缓慢加至15 mL淋巴细胞分离液[LSM（Cellgro在新的50 mL聚苯乙烯圆锥管中。
- 50 mL 离心管随后在 1200 x g 20分钟，松开刹车。
- 小心地从离心机中取出50 mL离心管，避免扰动LSM与培养基之间的界面。用10 mL移液管收集界面处的细胞，并转移至新的50 mL聚苯乙烯圆锥形离心管中。
- 收集的界面用含2% FBS的PBS稀释至终体积50 mL。
- 含有稀释后界面相的50 mL离心管在1200 x g 保持刹车状态 10 分钟。
- 离心后，吸除上清液，将沉淀物重悬于10 mL含2% FBS的PBS中。
- 将细胞悬液合并至一个50 mL锥形管中，并用含2% FBS的PBS稀释至50 mL。
- 含有混合细胞悬液的试管在300 x g 10 分钟，以去除所有残留的 LSM。
- 上清液被吸除，沉淀物随后重悬于10 mL RPMI-1640培养基中（HyClone) 含10% FBS、100 U/ml 青霉素、100 mcg/ml 链霉素的培养基HyClone）和 2 mM L-谷氨酰胺（CellGro（RPMI完全培养基）并使用血细胞计数板进行计数。
- 纯化后的CD4+ T细胞浓度随后调整为3x106/mL，使用含完全培养基的RPMI。
- CD4+ T细胞随后通过与连接有抗CD3/抗CD28的微珠共同培养进行刺激 [T细胞扩增试剂盒（Miltenyi Biotec)] 按每细胞三个磁珠的比例作用 72 小时 37°C 在5% CO₂环境中2 加湿培养箱
2. 用 HIV-1 感染 CD4+ T 细胞（见图 1）
- 从培养板中取出含有经刺激的 CD4+ T 细胞的细胞悬液，使用血细胞计数板进行细胞计数。
- 将 CD4+ T 细胞（约 2×106）加入一个 15 mL 圆锥形离心管中，作为未感染对照组使用。
- 将剩余的 CD4+ T 细胞悬液转移至一个 50 mL 圆锥形离心管中用于感染操作。
- 将含有 CD4+ T 细胞悬液的离心管在 300 × g 条件下离心 10 分钟，并吸除上清培养液。
- 将经刺激的 CD4+ T 细胞直接重悬于含有病毒颗粒的培养液中，随后在 20–25°C 条件下以 1200 × g 离心 2 小时进行旋感染9。通常，我们使用感染复数（MOI）为 5 的复制缺陷型 HIV 毒株（例如 DHIV-3）或 MOI 为 0.01 的复制 competent 病毒（例如 HIV-1NL4/3）感染 CD4+ T 细胞。最终体积无需精确控制，但离心时必须平衡离心管。在旋感染前，向培养液中加入 Polybrene（Santa Cruz），终浓度为 10 mcg/mL。
- 旋感染完成后，移除上清液，并将细胞重悬于 RPMI 完全培养基中，细胞密度为 3×106/mL，培养基中补充 100 U/mL IL-2。若使用复制缺陷型病毒，则感染组与未感染组细胞继续培养 72 小时；若使用复制 competent 病毒，则培养 5–7 天。培养期间应每 48 小时更换一次培养基。
3. 从外周血中分离人自然杀伤细胞
- 从用于分离CD4+ T细胞的同一供体采集外周静脉血（约100 ml）至真空采血管中 含钠肝素的试管（Becton Dickinson).
- 然后将血液从真空采血管中转移 将溶液以20 mL等分试样分装至50 mL锥形管中。
- The Vacutainer 随后用 8 mL 无钙镁亨克氏平衡盐溶液 [HBSS (Hyclone)]，并将洗涤液转移至含有20 mL外周血的50 mL锥形管中。每个50 mL锥形管中的最终体积为35 mL。
- 将稀释后的血液叠加于新取的50 mL离心管中15 mL LSM液面上，然后以400 x g离心 g 30分钟，松开刹车。
- 将离心管小心地从离心机中取出，使用10 mL移液器吸取每根管中LSM与培养基之间的界面层，转移至新的50 mL锥形管中。
- 细胞悬液用CMF HBSS洗涤一次（400 × g离心） g 保持刹车状态15分钟。
- 第一次洗涤后，弃去上清液，将所得沉淀合并至一个50 mL锥形管中，用CMF HBSS洗涤两次（30 × g离心） g 静置10分钟（刹车开启），以去除所有残留的LSM。
- 最后一次洗涤后，将沉淀重悬于10 mL ACK裂解缓冲液（150 mM NH₄Cl，10 mM KHCO₃，0.1 mM EDTA，pH 7.2–7.4）中4Cl, 1.0 mM KHCO₃3 和 0.1 mM EDTA（pH 7.3）中，室温（20–25°C) 5分钟。此步骤对于去除外周血单个核细胞（PBMC）中污染的红细胞是必要的。
- 10分钟后，向细胞悬液中加入40 mL CMF PBS以终止裂解反应。
- 含有PBMC和裂解红细胞的细胞悬液管随后在300 x g 保持刹车状态 10 分钟。
- 弃去上清液，将沉淀物重悬于 5 mL 含 2% FBS 和 2 mM EDTA 的 PBS 中，并使用血细胞计数板进行计数。
- 然后使用NK细胞分离试剂盒［阴性选择-人（Miltenyi Biotec)] 按照制造商说明书进行操作。
- 将层析柱的穿流液收集至15 ml离心管中，于300 x g离心 g 保持刹车状态10分钟。
- 弃去上清液，重悬沉淀。将重悬的沉淀合并至一个离心管中，总体积为1 mL的Iscove改良Dulbecco培养基[IMDM(Gibco)] 添加 10% AB+ 热灭活（56°C 30分钟）人血清（HS），并用血细胞计数板计数。
- 用含10% HS的IMDM调节细胞悬液的体积，使NK细胞的最终密度为3x106/mL。将细胞悬液等分为两份。其中一组自然杀伤细胞（NK细胞）加入200 U/mL重组人白细胞介素-2；另一组细胞则置于不含细胞因子的培养基中培养。
- NK细胞培养物随后在37°C、5% CO₂培养箱中过夜孵育 37°C，5% CO₂2
- 将所得的NK细胞用作效应细胞，进行CD107a脱颗粒实验或 51Cr释放实验
4. HIV-1 感染细胞的纯化（见图1）
- 从培养板中移除含有感染细胞的培养液，并在开启制动的情况下以 300 x g 离心 10 分钟。
- 吸除上清液，将沉淀用含 2% FBS 和 2 mM EDTA 的 2 mL PBS 重悬，并用血细胞计数板对细胞进行计数。
- 利用 HIV-1 可下调 CD4 表达的特性，将不含 HIV-1 的感染细胞与携带病毒的细胞分离开。为此，使用 CD4 阳性分离试剂盒（Invitrogen），按照生产商说明书操作，但采用每细胞一个 a-CD4 磁珠的比例。
- 在去除 CD4+ T 细胞后，使用死亡细胞去除试剂盒（Miltenyi Biotec）按照生产商说明书从携带病毒的纯化细胞群体中去除死细胞。
- 柱中去除死亡细胞后的穿流液在开启制动的情况下以 300 x g 离心 10 分钟。弃去上清液，将沉淀用 1 mL RPMI 完全培养基重悬，并对细胞进行计数。
- 纯化后的感染细胞现已可用于 CD107a 脱颗粒实验或 51Cr 释放实验中的靶细胞。
5. CD107a 脱颗粒检测（见图2）
- 将NK细胞培养物从培养板中取出，计数细胞悬液。
- NK细胞悬液在300 x g 保持刹车状态下持续10分钟。
- NK细胞用RPMI完全培养基重悬，并调整终浓度至106 cells/mL
- 上述步骤中获得的感染与未感染T细胞的细胞悬液在300 x g下离心 g 保持刹车状态 10 分钟。
- 上清液被移除，沉淀物在 RPMI 完全培养基中重悬，浓度为 2×10⁶6 cells/mL
- K562 细胞被用作阳性对照靶细胞，因为它们对自然杀伤细胞（NK）介导的裂解高度敏感。将细胞以 300 x g 刹车状态下离心10分钟，弃上清，沉淀物重悬于RPMI完全培养基中，浓度为2×10⁶6 cells/mL
- 在96孔V型底培养板中，向各孔加入100 μL靶细胞和100 μL效应细胞。
- 一个含有100 mcL效应细胞和100 mcL不含靶细胞的培养基的孔，将用于检测NK细胞的非特异性脱颗粒。
- 向每个孔中加入 10 mcL FITC 标记的抗 CD107a 抗体（BDIS）。
- 然后以20 x g 刹车状态下持续2分钟。
- 离心后的孔板在 37°C 和 5% CO₂2.
- 孵育后，将培养板在400 x g条件下离心 g 刹车状态下持续5分钟。
- 弃去上清液，保留沉淀。
- 每个孔中加入100 μL流式缓冲液（PBS含2% FBS和0.1% NaN₃），冰上孵育20分钟，使用以下荧光素标记抗体组合进行染色。3)
- 抗 CD3/14/20 [太平洋蓝标记（Biolegend)]
- 抗-CD56 [APC(Biolegend)]
- 20分钟孵育后，向每孔加入200 μL流式缓冲液，将培养板在400 × g离心 g 刹车状态下持续5分钟。
- 然后使用装有200 μL微量移液枪头的2 mL抽吸移液管，小心地从每个孔中吸去流动缓冲液，注意勿扰动沉淀。
- 重复步骤15和16一次。
- 沉淀物用200 μL含1%多聚甲醛的无钙镁PBS缓冲液重悬。将细胞悬液转移至流式管中。
- 通过向每管中加入约100 μL含1%多聚甲醛的无钙镁PBS溶液，将总体积调至300 μL。
- 事件（2×104）对应的自然杀伤细胞通过流式细胞仪使用FACS DIVA软件进行收集BDIS) 软件进行数据采集，并使用 Flow Jo 软件进行分析(TreeStar).
6. CD107a 设门策略（见图3）
- 使用前向散射光高度（FSC-H）与前向散射光宽度（FSC-W）散点图建立单细胞门。
- 在单细胞门基础上，通过前向散射光（FSC）与侧向散射光（SSC）散点图分析细胞大小与颗粒度。通常，淋巴细胞具有相对较低的颗粒度和中等的细胞大小。
- 将淋巴细胞门内的细胞绘制在CD3/14/20标记细胞与CD56标记细胞的双色点图中，以圈选自然杀伤细胞（NK细胞），同时排除单核细胞（CD14）、T细胞（CD3）和B细胞（CD20）。
- 对CD56pos门内细胞群体进一步分析CD107a表达情况。
- 以无靶细胞的NK细胞组用于设定CD107a阴性表达的门控标准。
7. 51Cr 释放实验（见图4）
- 被感染的靶细胞用 125 mcCi 标记 51Cr (Perkin Elmer) 在生理盐水/106 细胞在总体积500 mcL中孵育2小时 37°C 和5% CO2作为阳性对照，106 K562 细胞用 100 mcCi 进行标记 51Cr 在总共 500 mcL 中孵育 2 小时 37°C 和 5% CO2用RPMI完全培养基定容至500 μL。该体积的 51此处使用以下链接计算添加到靶细胞的 Cr：(http://las.perkinelmer.com/Catalog/RadCalculator.htm?Mode=RadioactivityCalculator)
- 在靶细胞标记的同时，将先前分离的NK细胞从培养液中取出并计数。含有NK细胞的细胞培养物在300 x g 刹车状态下持续10分钟。
- 含有NK细胞的沉淀重悬于RPMI完全培养基中，并分至3个管中。细胞密度调整至105/mL 于一个离心管中，2.5×105/ml 加入第二个试管，以及 5×105/mL 在第三个试管中。
- 标记的靶细胞从培养箱中取出，每管加入 4.5 mL RPMI-complete 培养基。随后将各管以 300 × g 离心 g f或10分钟。
- 小心倾倒上清液，避免扰动沉淀，将上清液倒入放射性液体废物容器中。
- 步骤4和步骤5再重复两次，以去除所有未吸附的物质 51第三次洗涤的上清液可弃置于非放射性液体废物容器中。
- 标记后的靶细胞重悬于RPMI完全培养基中，最终细胞密度为105/mL
- 将100 mcL标记的靶细胞分装至96孔V型底板的各孔中，最终细胞数量为104 靶细胞/孔
- 表1 是一个典型设置的示例 51Cr释放实验。每组设三个重复。
1 2 3 4 5 6 7 8 9 A K562 效应细胞:靶细胞 (1:1) K562 效靶比（1:1） K562 效靶比（1:1） K562 E:T（2.5:1） K562 E:T（2.5:1） K562 E:T（2.5:1） K562 E:T（5:1） K562 效靶比（5:1） K562 效靶比（5:1） B UI E:T (1:1) UI E:T (1:1) UI E:T (1:1) UI E:T (2.5:1) UI E:T (2.5:1) UI E:T (2.5:1) UI E:T (5:1) UI E:T (5:1) UI E:T (5:1) C HIV-1 感染的 E:T（1:1） HIV-1 感染的 E:T（1:1） HIV-1 感染的 E:T（1:1） HIV-1 感染的 E:T（2.5:1） HIV-1 感染的 E:T（2.5:1） HIV-1 感染的 E:T（2.5:1） HIV-1 感染的 E:T（1:1） HIV-1 感染的 E:T（1:1） HIV-1 感染的 E:T（1:1） D E F K562 自发释放 K562 自发释放 K562 自发释放 UI 自发释放 UI 自发释放 UI 自发释放 HIV-1 感染的自发释放 HIV-1 感染的自发释放 HIV-1 感染的自发释放 G K562 最大释放量 K562 最大释放量 K562 最大释放量 UI 最大释放量 UI 最大释放量 UI 最大释放量 HIV-1 感染最大释放量 HIV-1 感染最大释放量 HIV-1 感染最大释放量 - 将上述NK细胞悬液各100 mcL加入含有靶细胞的每孔中。
- 在最大释放组和自发释放组中，向未含有效应细胞的相应孔中加入 100 mcL 的靶细胞。自发释放组 дополнительно 加入 100 mcL RPMI 完全培养基，并进行孵育。
- 96孔板在20 x g 刹车状态下持续2分钟。
- 离心后的培养板随后在指定条件下孵育 37°C 和 5% CO2 4小时。
- 4小时孵育后，除最大释放孔外，向每孔加入5 μL按1:10比例稀释于RPMI完全培养基中的人红细胞。
- 向最大释放孔中加入100 μL 10%十二烷基硫酸钠。
- 将培养板在400 x g条件下离心 g 5 分钟以沉淀细胞。
- 从每个孔中收集 100 mcL 无细胞上清液，分别放入独立的γ计数管中（Perkin Elmer. 将试管放入2470自动γ计数器（Perkin Elmer）。量的多少 51通过2分钟读数的平均值，测量培养液中的铬（Cr）放射性，单位为每分钟计数（counts per minute）。
- 样品和对照的每分钟计数（CPM）读数用于计算特异性裂解率，计算公式如下：
[(实验CPM值 - 自发性CPM均值) / (最大CPM均值 - 自发性CPM均值)] × 100
8. 代表性结果：
图1. 从外周血中分离自然杀伤细胞及制备HIV-1感染靶细胞的步骤。
图2. 利用NK细胞作为效应细胞，K562细胞、未感染的CD4+ T细胞及HIV-1感染的T细胞作为靶细胞，构建CD107a脱颗粒实验的步骤。
图3. CD107a脱颗粒实验的流式细胞术设门策略。 （A）基于FSC-A（前向散射面积）对FSC-H（前向散射高度）的散点图，对单个细胞设门，并排除细胞团或双联体。（B）将单细胞门内的细胞在FSC-A对SSC（侧向散射）的图中显示，对淋巴细胞群体设门。（C）将淋巴细胞门内的细胞在CD3/14/20（T细胞、单核细胞、B细胞）对CD56（自然杀伤细胞）的图中显示，设门于CD56pos且CD3/14/20neg的细胞群体（NK门）。（D）将NK门内的细胞在CD107a对CD56的图中显示，以识别发生脱颗粒的自然杀伤细胞（CD107apos）。
图4. 构建过程中的步骤 51使用NK细胞作为效应细胞，K562细胞、未感染的CD4+ T细胞以及HIV-1感染的T细胞作为靶细胞的Cr释放实验。
图 5. 评估自然杀伤细胞对 HIV-1 感染细胞的细胞毒性反应的代表性结果。 （A）通过检测表达表面 CD107a 的 NK 细胞百分比，评估 NK 细胞在无靶细胞以及针对 K562 细胞、原代 CD4+ T 细胞和 HIV 感染的原代 T 细胞时的脱颗粒能力。各象限中的数值代表占总 NK 细胞的百分比。（B）通过 51Cr 释放实验，在不同效应细胞与靶细胞比例（E:T）下，评估 NK 细胞对 K562 细胞、未感染的 CD4+ T 细胞以及 HIV-1 感染的 T 细胞的裂解能力。
讨论
若操作得当，本实验方案所述检测方法应能准确反映自然杀伤细胞（NK细胞）对HIV-1感染细胞的脱颗粒能力及裂解能力（见图5）。NK细胞在HIV感染细胞刺激下发生的脱颗粒反应，与其对HIV感染细胞的裂解作用应呈正相关10. 获得两种自然杀伤细胞功能检测中针对HIV感染细胞的细胞毒反应的可靠结果，依赖于高度纯化的NK细胞以及高度纯化的感染细胞群体的分离。获得纯化的NK细胞和HIV-1感染细胞对于实现较为准确的效应细胞与靶细胞比例至关重要。同样，在进行检测前，从靶细胞群体中去除死亡和凋亡细胞也非常重要 51Cr标记或与效应细胞共孵育。 51在同位素标记步骤中，若存在死亡或凋亡细胞，铬（Cr）可能被正在凋亡的细胞摄取，导致自发释放率显著升高，从而影响计算所得的特异性裂解百分比。此外，死亡或凋亡细胞的存在可能诱发自然杀伤（NK）细胞脱颗粒，引起CD107a表达水平异常升高。在NK细胞与靶细胞共孵育后，吸取无细胞上清液时需精确移液。 51Cr 释放实验，因为从每个重复孔中移取的上清液体积不同会导致标准差较大。可通过修改这些方案来评估特定 NK 受体在介导 NK 细胞裂解 HIV 感染细胞中的作用，方法是在效应细胞或靶细胞共培养前，用针对特定受体或配体的拮抗性抗体进行预孵育。 6,11经细胞因子处理的NK细胞（如IL-2、IL-15）可用于评估刺激后NK细胞的功能活性 12同样，可利用这些方案进行抗体依赖性细胞毒性试验。可将抗HIV抗体（例如抗gp120）加入靶细胞，以供自然杀伤细胞的低亲和力Fc受体CD16识别。 13这些检测方法虽然旨在测量自然杀伤细胞对HIV感染细胞的细胞毒反应，但也可经修改用于检测自然杀伤细胞在识别HIV感染细胞后产生细胞因子的能力。尽管本方案中描述了使用 体外 以感染细胞作为靶细胞，我们近期描述了从HIV感染者体内生成靶细胞的方法。该方法需要分离CD4+ T细胞，然后在含有白细胞介素-2的条件下，通过有丝分裂原刺激，对细胞进行为期两周的扩增。 11经过两周的扩增后，采用本文所述的方案分离目标细胞。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 真空采血管（肝素钠） | BD Biosciences | 367874 | |
| RosetteSep CD4+ T细胞分离试剂盒 | Stem Cell Technologies | 15062 | |
| 无钙镁PBS | Hyclone | SH30256.01 | |
| 胎牛血清 | Hyclone | 10437-028 | |
| 淋巴细胞分离液 | Cellgro | 25-072-CV | |
| RPMI-1640培养基 | Hyclone | SH30096.01 | |
| 青霉素/链霉素 | Hyclone | SV30010 | |
| L-谷氨酰胺 | Cellgro | 25-005-Cl | |
| T细胞扩增试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-091-441 | |
| 无钙镁HBSS（1×） | Hyclone | SH30588.01 | |
| 0.5 M EDTA | 46-034-Cl | ||
| NK细胞阴性分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-092-657 | |
| IMDM培养基 | GIBCO, by Life Technologies | 12440-046 | |
| CD4+阳性分离试剂盒 | Invitrogen | 113.31D | |
| 死细胞去除试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| 聚凝胺 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-134220 | |
| CD3 PacificBlue | BD Biosciences | 558117 | |
| CD14 PacificBlue | Biolegend | 325616 | |
| CD20 PacificBlue | Biolegend | 302328 | |
| CD56 APC | Biolegend | 318310 | |
| CD69 PE | BD Biosciences | 555531 | |
| CD107a FITC | BD Biosciences | 555800 | |
| 51铬 | PerkinElmer, Inc. | NEZ030002MC | |
| γ计数管 | PerkinElmer, Inc. | 1270-401 | |
| 2470自动γ计数器 | PerkinElmer, Inc. | 2470-0050 | |
| FACS Diva | BD Biosciences | 643629 | |
| FlowJo | Tree Star, Inc. | FJ-9-1YR |
参考文献
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