荧光光谱法测定膜蛋白折叠的热力学

摘要

本视频文章详细介绍了通过色氨酸荧光法测定膜蛋白折叠吉布斯自由能的实验步骤。

摘要

膜蛋白折叠是一个具有基础科学意义和健康相关性的新兴研究领域。细胞中膜蛋白的丰富性凸显了对这一普遍存在的蛋白家族折叠过程进行全面研究的必要性。此外，我们在表征与错误折叠蛋白相关疾病方面的能力不断进步，推动了蛋白质折叠领域大量的实验和理论研究工作。然而，由于膜蛋白本身固有的挑战性以及折叠机制的复杂性，这一重要领域的快速发展受到了限制。本文概述了一种实验方法，用于测定来自大肠杆菌（E. coli）的一种典型整合膜蛋白在无变性剂条件下的解折叠吉布斯自由能（ΔG°_H2O）这一热力学参数。该实验方案重点利用荧光光谱法，通过检测不同变性剂浓度下折叠态与解折叠态的平衡分布来确定其相对比例。文中强调了合成脂质囊泡制备过程中的实验注意事项，以及数据分析流程中的关键步骤。该技术具有良好的通用性，可适用于不同类型的变性剂（如温度和pH）以及多种折叠环境（如脂质双分子层和胶束）。本方案可推广应用于任何满足下文所述标准的膜蛋白或可溶性蛋白。

方案

1. 用于膜蛋白折叠的约50 nm直径小单层囊泡（SUVs）的制备

1. 购买含有1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱（DMPC）脂质的氯仿溶液，并将每瓶20 mg的等分试样分装至洁净的玻璃小瓶中用于储存。向每个小瓶中通入氮气层以防止脂质氧化，然后用瓶盖和封口膜密封。小瓶储存于-20°C冰箱中，直至使用。
2. 每次实验使用一个含有20 mg脂质氯仿溶液的单个小瓶。将小瓶内容物用氮气流吹干1小时，直至溶剂完全挥发。
3. 将干燥的脂质用1 mL 20 mM磷酸钾缓冲液（pH = 7.3）在水浴超声仪中重悬约30秒。此脂质悬浮液呈浑浊状，转移至底部锥形的15 mL塑料离心管中。向原先盛有脂质的空玻璃小瓶中再加入1 mL磷酸缓冲液，重复超声处理，随后将溶液加入同一15 mL离心管中。该过程共重复4次，最终管内体积为4 mL，所得脂质浓度为5 mg/mL，即为储备脂质体溶液。
4. 将4 mL脂质体溶液置于约30°C的温水浴中，使用超声破碎仪微探头以50%占空比超声处理1小时。水浴的作用有两个：第一，防止超声过程中脂质溶液温度过高；第二，保持水相脂质溶液的温度高于双分子层相变温度，对于DMPC而言，该相变温度约为23°C。
5. 将超声处理后的溶液通过0.22 μm注射器滤器过滤，以去除来自超声探头的碎片，过滤后的溶液在37°C下平衡过夜。

2. 初始荧光去折叠曲线的样品制....

讨论

本方案描述了含有色氨酸残基的膜相关蛋白和肽的去折叠曲线的生成方法。此处假设色氨酸荧光信号能够反映蛋白是否处于折叠状态并插入合成脂质囊泡中，或是在溶液中处于去折叠状态。本报告中还采用了其他假设，例如两态折叠模型以及自由能与变性剂浓度呈线性关系；若修改这些假设，则需使用不同的方程。² 实验方案可轻松调整，以采用其他光谱学可观测量，如圆二色性、吸收光谱或外源染料的荧光信号，³ 也可结合凝胶电泳技术。⁴ 此外，可选用不同的变性剂，如盐酸胍、酸性溶液或温度变化，以及不同类型的脂质/囊泡，例如带负电荷的脂质、大单层囊泡或胶束。^5,6 最后，该方案适用于任何满足可逆折叠条件、并具有光谱学或其他可观测标记以区分不同构象状态的膜蛋白、膜相关肽段以及可溶性蛋白/肽段。对于可溶性蛋白，显然无需在方案中加入囊泡。

去折叠的吉布斯自由能提供了关于稳定生物大分子的非共价相互作用的信息。在本实验室中，我们测定了外膜蛋白A（OmpA）突变体的去折叠曲线，这些突变体在不同位置含有单个色氨酸残基，并报道了与含有五个天然色氨酸残基的.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMPC	Avanti Polar Lipid, Inc	850345C
尿素	MP Biomedicals	04821527
磷酸氢二钾	Fisher Scientific	P288
磷酸二氢钾	Fisher Scientific	P285