本视频文章详细介绍了通过色氨酸荧光法测定膜蛋白折叠吉布斯自由能的实验步骤。
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摘要
摘要
膜蛋白折叠是一个具有基础科学意义和健康相关性的新兴研究领域。细胞中膜蛋白的丰富性凸显了对这一普遍存在的蛋白家族折叠过程进行全面研究的必要性。此外，我们在表征与错误折叠蛋白相关疾病方面的能力不断进步，推动了蛋白质折叠领域大量的实验和理论研究工作。然而，由于膜蛋白本身固有的挑战性以及折叠机制的复杂性，这一重要领域的快速发展受到了限制。本文概述了一种实验方法，用于测定来自大肠杆菌（E. coli）的一种典型整合膜蛋白在无变性剂条件下的解折叠吉布斯自由能（ΔG°H2O）这一热力学参数。该实验方案重点利用荧光光谱法，通过检测不同变性剂浓度下折叠态与解折叠态的平衡分布来确定其相对比例。文中强调了合成脂质囊泡制备过程中的实验注意事项，以及数据分析流程中的关键步骤。该技术具有良好的通用性，可适用于不同类型的变性剂（如温度和pH）以及多种折叠环境（如脂质双分子层和胶束）。本方案可推广应用于任何满足下文所述标准的膜蛋白或可溶性蛋白。
方案
1. 用于膜蛋白折叠的约50 nm直径小单层囊泡（SUVs）的制备
- 购买含有1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱（DMPC）脂质的氯仿溶液，并将每瓶20 mg的等分试样分装至洁净的玻璃小瓶中用于储存。向每个小瓶中通入氮气层以防止脂质氧化，然后用瓶盖和封口膜密封。小瓶储存于-20°C冰箱中，直至使用。
- 每次实验使用一个含有20 mg脂质氯仿溶液的单个小瓶。将小瓶内容物用氮气流吹干1小时，直至溶剂完全挥发。
- 将干燥的脂质用1 mL 20 mM磷酸钾缓冲液（pH = 7.3）在水浴超声仪中重悬约30秒。此脂质悬浮液呈浑浊状，转移至底部锥形的15 mL塑料离心管中。向原先盛有脂质的空玻璃小瓶中再加入1 mL磷酸缓冲液，重复超声处理，随后将溶液加入同一15 mL离心管中。该过程共重复4次，最终管内体积为4 mL，所得脂质浓度为5 mg/mL，即为储备脂质体溶液。
- 将4 mL脂质体溶液置于约30°C的温水浴中，使用超声破碎仪微探头以50%占空比超声处理1小时。水浴的作用有两个：第一，防止超声过程中脂质溶液温度过高；第二，保持水相脂质溶液的温度高于双分子层相变温度，对于DMPC而言，该相变温度约为23°C。
- 将超声处理后的溶液通过0.22 μm注射器滤器过滤，以去除来自超声探头的碎片，过滤后的溶液在37°C下平衡过夜。
2. 初始荧光去折叠曲线的样品制备
- 配制含有10 M尿素的20 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.3）储备液。必须将水加入固体中（而非将固体加入水中），因为大量尿素在溶液中占据显著体积。该尿素溶液可通过将溶质加入洁净的空瓶中，并加水至预定最终体积来配制。此溶液可能需要在水浴或加热板上加热并搅拌以溶解溶质。尿素具有吸湿性，因此应通过折光率测定来确定尿素储备液的实际浓度。1
- 配制20 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.3）的储备缓冲液。
- 制备去折叠蛋白的储备溶液。该蛋白储备液应含有约200 μM蛋白，溶于8 M尿素和20 mM磷酸盐缓冲液中。
- 荧光研究样品按以下方式制备：混合适量的蛋白储备液（第2.3节）、脂质储备液（5 mg/mL脂质，第1节）、10 M尿素储备液（第2.1节）和磷酸盐缓冲液储备液（第2.2节），以获得含约4 μM蛋白、1 mg/mL脂质、以及0至8 M尿素（以1 M为增量）的样品。每个样品的总体积为200 μL。附有示例电子表格（表1），列出了使用200 μM蛋白储备液时所需的体积。
- 空白样品的制备方法如第2.4节所述，但不添加蛋白。为保持其他组分浓度与第2.4节相同，可加入4 μL的8 M尿素溶液代替蛋白。这些空白样品用于扣除蛋白荧光光谱中出现的散射及其他背景信号。
- 第2.4和2.5节的样品在测量荧光光谱前需在37°C下孵育至少2小时，以确保蛋白完全折叠并达到平衡。
3. 荧光光谱的测量
使用稳态荧光光谱仪测量每个样品及空白样的色氨酸荧光。为避免激发酪氨酸残基，荧光光谱应在290 nm激发波长下记录，并扫描305至500 nm范围。通常入口和出口狭缝宽度为3 nm。波长步进和积分时间可根据信噪比进行优化。典型的波长步进和积分时间分别为1 nm/步和0.5秒/步。膜蛋白通常仅在温度高于双分子层相变温度时才能正确折叠进入合成脂质中。因此，在本实验使用DMPC的情况下，样品温度保持恒定在30 °C。实验中采用容量为160 μL的微体积熔融石英比色皿。
4. 生成初始去折叠曲线并估算膜蛋白去折叠的吉布斯自由能
- 以 x-y 数据集形式的荧光光谱被导入 Igor Pro、Matlab、Origin 或 Excel 等软件中。
- 必须使用以下步骤扣除尿素和脂质囊泡背景的信号：
光谱 A = 蛋白质在脂质体存在及特定浓度尿素条件下的原始荧光光谱。
光谱B = 对应空白样品的原始荧光光谱，该空白样品含有脂质囊泡及与光谱A相同的尿素浓度；空白样品中不含蛋白质。
校正光谱 = 光谱A - C×光谱B。C为标量，通常等于1.0。在某些情况下，由于散射问题导致在约305–320 nm区域附近出现过度或不足扣除，C可能小于或大于1.0。 - 最大荧光发射波长，λ最大值，根据每种尿素浓度的校正光谱进行列表。完全去折叠膜蛋白的典型值为350 nm，而折叠蛋白的典型值约为330 nm。将列表中的波长通过将λ的范围转换为去折叠分数来换算最大 值（约330至约350 nm）归一化至0.0到1.0范围，以关联λ最大 值对应未折叠群体的比例。例如，一个λ最大值 330 nm 处的值对应于未折叠分数 0.0，350 nm 处对应于 1.0，340 nm 处对应于 0.5。将蛋白质的未折叠分数对尿素浓度作图。如上所述，尿素浓度应通过测量折射率来实验确定。
- 我们假设该蛋白质可以处于两种状态之一：折叠态或去折叠态。去折叠分子所占比例的曲线图， f，相对于尿素浓度， C，可拟合到以下方程：2
系数 m 对应于自由能随变性剂浓度的变化率，以及 Cm 对应于折叠群体与去折叠群体相等时的中间尿素浓度。这些值是由数据分析软件通过最小二乘法拟合得到的拟合参数。 R （0.001987 kcal/mol • K）为气体常数，且 T 温度（303 K）。 - 拟合所得的系数用于确定在无尿素条件下蛋白质解折叠的吉布斯自由能（kcal/mol）：
.
5. 优化去折叠曲线以更精确测定去折叠吉布斯自由能。
- 上述去折叠曲线揭示了导致λmax发生最大变化的尿素浓度范围。该范围通常较小，大部分去折叠过程均发生在此狭窄区间内。为了精确测定去折叠的自由能，需在此区域内进一步分析额外样品，以获得包含足够多数据点的曲线，从而实现优化的最小二乘法拟合。例如，若蛋白质在2至4 M尿素之间发生去折叠，则可制备尿素浓度以0.2 M为增量、从2 M至4 M的系列样品，以更精确地揭示去折叠曲线中这一关键区域的形状。无需在每个尿素浓度下测量空白光谱，通常每约0.5 M间隔测量一次空白光谱即可。
- 由此图所得的去折叠自由能可能与原始去折叠曲线中的结果略有差异，但能反映更为精确的数值。
6. 代表性结果：
| 样品 | 终浓度 [尿素], M | 蛋白储存液 (μL) | 脂质储存液 (μL) | 10 M 尿素储存液 (μL) | 缓冲液储存液 (μL) |
| 1 | ~ 0.16 | 4 | 40 | 0 | 156 |
| 2 | 1 | 4 | 40 | 20 | 136 |
| 3 | 2 | 4 | 40 | 40 | 116 |
| 4 | 3 | 4 | 40 | 60 | 96 |
| 5 | 4 | 4 | 40 | 80 | 76 |
| 6 | 5 | 4 | 40 | 100 | 56 |
| 7 | 6 | 4 | 40 | 120 | 36 |
| 8 | 7 | 4 | 40 | 140 | 16 |
表1. 制备荧光样品所需的储备液体积
图1. 含单个色氨酸残基的约5 μM代表性膜蛋白的色氨酸荧光光谱。(A) 蛋白质的原始荧光光谱（来自4.2节的光谱A）；(B) 空白样的原始荧光光谱（来自4.2节的光谱B）；(C) 来自4.2节的校正后光谱。
图 2. 图1中膜蛋白在不同尿素浓度下的校正色氨酸荧光光谱。
图3. 根据图2数据获得的解折叠曲线，拟合至4.4节中的方程。吉布斯自由能根据4.5节计算得出。
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讨论
本方案描述了含有色氨酸残基的膜相关蛋白和肽的去折叠曲线的生成方法。此处假设色氨酸荧光信号能够反映蛋白是否处于折叠状态并插入合成脂质囊泡中，或是在溶液中处于去折叠状态。本报告中还采用了其他假设，例如两态折叠模型以及自由能与变性剂浓度呈线性关系；若修改这些假设，则需使用不同的方程。2 实验方案可轻松调整，以采用其他光谱学可观测量，如圆二色性、吸收光谱或外源染料的荧光信号，3 也可结合凝胶电泳技术。4 此外，可选用不同的变性剂，如盐酸胍、酸性溶液或温度变化，以及不同类型的脂质/囊泡，例如带负电荷的脂质、大单层囊泡或胶束。5,6 最后，该方案适用于任何满足可逆折叠条件、并具有光谱学或其他可观测标记以区分不同构象状态的膜蛋白、膜相关肽段以及可溶性蛋白/肽段。对于可溶性蛋白，显然无需在方案中加入囊泡。
去折叠的吉布斯自由能提供了关于稳定生物大分子的非共价相互作用的信息。在本实验室中，我们测定了外膜蛋白A（OmpA）突变体的去折叠曲线，这些突变体在不同位置含有单个色氨酸残基，并报道了与含有五个天然色氨酸残基的...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
我们感谢北京吴提供她的数据。本工作得到了J.E.K.获得的美国国家科学基金会CAREER奖的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMPC | Avanti Polar Lipid, Inc | 850345C | |
| 尿素 | MP Biomedicals | 04821527 | |
| 磷酸氢二钾 | Fisher Scientific | P288 | |
| 磷酸二氢钾 | Fisher Scientific | P285 |
参考文献
- Shirley, B. A. Protein Folding and Stability. Shirley, B. A. , Humana Press. 177-190 (1995).
- Pace, C. N. Determination and Analysis of Urea and Guanidine Hydrochloride Denaturation Curves. Methods Enzymol. 131, 266-279 (1986).
- Lau, F. W., Bowie, J. U. A Method for Assessing the Stability of a Membrane Protein. Biochemistry. 36, 5884-5892 (1997).
- Burgess, N. K., Dao, T. P., Stanley, A. M., Fleming, K. G. β-Barrel Proteins that Reside in the Escherichia coli Outer Membrane in Vivo Demonstrate Varied Folding Behavior in Vitro. J. Biol. Chem. 283, 26748-26758 (2008).
- Booth, P. J., Curnow, P. Folding scene investigation: membrane proteins. Curr. Opin. Struct. Biol. 19, 8-13 (2009).
- Hong, H., Tamm, L. K. Elastic coupling of integral membrane protein stability to lipid bilayer forces. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 4065-4070 (2004).
- Sanchez, K. M., Gable, J. E., Schlamadinger, D. E., Kim, J. E. Effects of Tryptophan Microenvironment, Soluble Domain, and Vesicle Size on the Thermodynamics of Membrane Protein Folding: Lessons from the Transmembrane Protein OmpA. Biochemistry. 47, 12844-12852 (2008).
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