免疫细胞化学：人类神经干细胞

摘要

免疫细胞化学是一种强大的方法，用于确定抗原在培养细胞中的存在、亚细胞定位以及相对丰度。本方案提供了一系列简单易行的步骤，可帮助节约抗体并最大限度地提高染色效果。

摘要

免疫细胞化学是一种非常强大且相对简单的方法，用于确定培养细胞中目标抗原（最常见的是蛋白质）的存在、亚细胞定位以及相对丰度。本方案提供了一系列易于操作的步骤，使研究人员能够在节约一抗和二抗用量的同时，获得高质量、可重复的定性和定量染色数据。该方案有两个方面有助于减少染色所需抗体的用量。首先，细胞培养在放置于组织培养板孔中的小型圆形盖玻片上。固定后，可将带有细胞的盖玻片从培养板孔中取出。进行抗体染色时，将带有细胞的盖玻片倒置在封口膜上的一小滴抗体溶液上，并用另一片封口膜覆盖，以防止干燥。采用此方法，每个盖玻片（或样本）仅需约 25 μl 抗体溶液即可完成染色。本方案描述的是人神经干细胞/前体细胞（hNSPCs）的免疫染色，但也可适用于许多其他类型的细胞。

方案

第1天：制备德国玻璃盖玻片及接种细胞

注意：德国产玻璃盖玻片通常更适用于原代神经干细胞和神经元的培养。我们采用以下清洗方案以提高细胞的贴附和铺展。将盖玻片置于一个小支架中，确保液体能够接触盖玻片的两侧。首先，将盖玻片在1% Liquinox溶液中孵育10分钟，随后用去离子水洗涤3次。确保无皂泡残留。接着，将盖玻片在1 M HCl中孵育30分钟，再用去离子水洗涤3次。在65°C下过夜干燥盖玻片。将盖玻片转移至玻璃皿中，并进行高压灭菌处理以达到灭菌目的。

1. 在组织培养超净台中，将无菌盖玻片放入大小合适的 孔板中。
   
   
2. 用层粘连蛋白包被盖玻片以促进细胞黏附。将盖玻片置于含10 µg/ml多聚-D-赖氨酸（PDL）的无菌水中，室温孵育5分钟。吸除PDL溶液，再将盖玻片置于含20 µg/ml层粘连蛋白的EMEM培养基中，在37°C组织培养孵箱中孵育4小时或过夜。
   
   
   
   1. 注意：请参考人类神经干细胞传代文章（https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263）和人类神经干细胞计数文章（https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=262），了解如何重悬和计数hNSPCs。
      
      
3. 用PBS冲洗经层粘连蛋白包被的盖玻片，并以特定密度将细胞接种至每个含有盖玻片的孔中（我们通常对用于免疫染色的细胞采用100,000–300,000个细胞/ml的初始接种密度）。
   
   
4. 将孔板放入37°C组织培养孵箱中，使细胞贴附于盖玻片（通常至少需要4小时）。

第2天：细胞的固定、通透、封闭及一抗孵育

注意：我们使用以下4%多聚甲醛固定液以保存细胞形态。该配方包含pH值的调整步骤，以使多聚甲醛充分溶解。我们更倾向于采用此方法而非加热溶解多聚甲醛，因为较高温度可能导致甲酸生成，从而在使用荧光染色时增加背景信号。固定液中的某些组分有助于维持细胞骨架结构（MgCl₂ 和 EGTA），而其他组分则有助于保持整体形态（蔗糖）。

用于细胞的4%多聚甲醛固定液

试剂和步骤：	固定液配制量（100 mL）：
MilliQ水	75 ml
多聚甲醛（在通风橱中称量）	4 g
10N NaOH，搅拌并逐滴加入直至溶液澄清	按需添加
10X PBS	10 ml
1M MgCl2	0.5 ml
0.5 M EGTA	2 ml
蔗糖	4 g
6N HCl，滴定至pH 7.4	按需添加
MilliQ水	加至100 ml
4°C保存，最多可保存1周。使用前预热至37°C

1. 在实验台上，移除培养基并加入预热的固定剂。孵育5-15分钟（根据待检测抗原的不同而定，通常使用10分钟）。此步骤及后续步骤均在室温下进行。
   
   
2. 将固定剂倒入适当的容器中处理，因为 许多机构将多聚甲醛视为危险废物。用PBS洗涤细胞3次，每次5分钟。移除液体时，注意避免抽吸导致细胞干燥。此外，每次更换溶液前，应提前准备好下一溶液，并在移除覆盖细胞的液体后立即加入新溶液，以防细胞干燥。
   
   
3. 如果目标抗原位于细胞内，则必须使细胞膜通透，以允许抗体进入。为实现细胞通透化，使用新鲜配制的含0.3% Triton X-100的PBS溶液。由于Triton黏稠，应缓慢移液，并确保去垢剂在加入细胞前已完全溶解于PBS中。通透化处理5分钟后，用PBS洗涤细胞3次，每次5分钟。
   
   
4. 必须使用封闭剂处理细胞，以防止抗体非特异性结合。我们使用牛血清白蛋白（BSA）作为封闭剂。封闭液的配制方法为：将5% BSA溶解于PBS中（置于摇床或旋转器上缓慢溶解，因溶解需要一定时间），然后使用0.45 µm注射器滤器过滤溶液。将细胞在5% BSA/PBS溶液中于室温下封闭1小时。

将一抗（最好针对目标蛋白具有特异性）用1% BSA/PBS（通过5% BSA/PBS稀释配制）稀释至预先确定的浓度。将稀释后的一抗溶液（每25 mm盖玻片加30 µl，每18 mm盖玻片加20 µl，每12 mm盖玻片加15 µl）滴加在覆有帕拉膜的玻璃板上。用镊子夹取带有固定细胞的盖玻片，翻转使其细胞面朝下，覆盖在抗体溶液上，使细胞与抗体充分接触。在整体结构上方再覆盖一条帕拉膜条。4°C条件下孵育过夜。

第3天：洗涤、二抗孵育、核染色与封片

1. 小心移除顶部的封口膜条，取出盖玻片，将其翻转后重新放回含有 PBS 的孔板中，确保细胞面朝上，以便进行后续洗涤。
   
   
2. 用 PBS 洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟。
   
   
3. 选择能够识别一抗的二抗。例如，如果一抗由兔产生，则二抗应能识别兔 IgG。同时需注意匹配抗体的同种型（IgG、IgM 等）。若使用多种一抗，应确保它们来自不同物种或具有不同同种型，并计划使用带有不同标记的二抗进行检测。例如，可使用与红色荧光染料偶联的抗兔二抗，以及与绿色荧光染料偶联的抗鼠二抗。将细胞与用 1% BSA 适当稀释的二抗溶液在室温下避光孵育 2 小时（操作方法与一抗相同，视频中未展示步骤）。若二抗以甘油溶液形式保存，则所需孵育体积可能略大于一抗（每张 25 mm 盖玻片需 40 µl，18 mm 盖玻片需 30 µl，12 mm 盖玻片需 25 µl）。
   
   
   • 注意：若使用荧光分子标记二抗，则自加入二抗后需将样品避光处理。孵育过程应在暗处或用铝箔包裹的培养板中进行。
     
     
4. 按照一抗操作所述方法小心从封口膜上取下盖玻片。用 PBS 洗涤细胞 2 次，每次 5 分钟，随后在 PBS 中加入终浓度为 2 µg/ml 的 Hoechst 核染料（若需进行核复染），孵育 1 分钟。若 Hoechst 染料较陈旧且信号过弱，可适当延长孵育时间和/或提高染料浓度。Hoechst 孵育后，用 PBS 洗涤 1 次，每次 5 分钟。
   
   
5. 应将盖玻片用封片剂封固于载玻片上，以便在显微镜下观察。若使用荧光分子标记二抗，则所用封片剂应含有防止光漂白的成分。我们通常使用 Vectashield 作为荧光封片剂。在载玻片上滴加适量体积的 Vectashield（每张 25 mm 盖玻片滴加 12 µl，18 mm 盖玻片滴加 6 µl，12 mm 盖玻片滴加 3 µl）。
   
   
6. 小心取出盖玻片，用去离子水冲洗背面以去除盐分（来自 PBS）。用无尘纸或纸巾轻轻吸去多余水分，然后将细胞面朝下置于 Vectashield 液滴上。将盖玻片倾斜放置，缓慢放下以避免产生气泡。在载玻片上标注日期及样品相关信息。
   
   
7. 将带有盖玻片的载玻片在避光条件下干燥，随后用吸水纸吸去盖玻片边缘多余的 Vectashield。如有需要，可用指甲油密封盖玻片边缘（尤其适用于在倒置显微镜下观察的样品）。我们通常将制备好的载玻片保存于 -20°C 冰箱中。

讨论

本方案描述了一种针对人神经干细胞前体细胞（hNSPCs）的免疫染色方法，可最大限度减少所需抗体的用量，同时实现可靠的细胞染色。该方案所述步骤最适合用于细胞内抗原的染色，但也可进行修改，以用于细胞表面分子的染色或增强细胞骨架的染色效果。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
德国玻璃（Deutsche Spiegelglas）盖玻片	工具	Carolina Biological	WW-63-3029	提供 12、15、18、22、25 mm 盖玻片
Liquinox 无磷酸盐洗涤剂	试剂	Sigma-Aldrich	Z273279	非常黏稠
聚-D-赖氨酸氢溴酸盐	试剂	Sigma-Aldrich	P7280
天然小鼠层粘连蛋白	试剂	Invitrogen	23017-015
EMEM (1X)	试剂	Mediatech, Inc.	MT-10-010-CV	由 Fisher 以所示目录号分销
24 孔板	工具	Fisher Scientific	08-772-1
曲拉通 X-100	试剂	Fisher Scientific	BP151-500	非常黏稠
多聚甲醛	试剂	Sigma-Aldrich	P6148	潜在致癌物，使用粉末和溶液时需谨慎
无 IgG 牛血清白蛋白	试剂	Jackson ImmunoResearch	001-000-161
H–chst 33342	试剂	Invitrogen	H-1399
Vectashield	试剂	Vector Laboratories	H-1000	黏稠