免疫组化:人类神经干细胞

摘要

免疫细胞化学是一个功能强大的方法来确定是否存在，亚细胞定位和兴趣在培养的细胞抗原的相对丰度。该协议提出了一个易于遵循的一系列步骤，使一个保护抗体染色。

摘要

免疫细胞化学是一个非常强大的，相当简单的方法，确定存在的，亚细胞定位，利益，最常见的在培养细胞中的蛋白质，的抗原的相对丰度。此协议提供了一个易于遵循一系列的措施，将使研究人员能够节省小学和中学的抗体，而其染色质量高，重现性好定性和定量数据。这个协议有两个方面，以帮助保护抗体染色所需的量。其一，细胞是生长在小的，圆形盖玻片，放置在一个组织的文化板块井。盖玻片上的细胞固定后，可以删除从该板块的水井。抗体染色，与细胞的盖玻片上的封口膜的小滴的抗体溶液倒到第二件的封口膜覆盖，以防止干燥。使用这种方法，只〜25μl抗体溶液的需要为每个盖玻片（或样品）进行染色。本协议描述了人类神经干/前体细胞（hNSPCs）免疫，但可用于许多其他类型的细胞。

方案

第1天:准备德国盖玻片和种子细胞

注 :德国盖玻片往往是最好培养初级的神经干细胞和神经元。我们使用下面的清洗方案，提高细胞的粘附和铺展。在一个很小的机架位置盖玻片盖玻片两侧，将允许液体访问。首先，在10分钟的1％Liquinox孵化盖玻片，其次是3用去离子水洗涤。确保没有肥皂泡保持。接下来，在1M盐酸，30分钟的孵育单用去离子水洗涤3。干盖玻片在65 ° C过夜。转移到一个玻璃盘和高压灭菌消毒的盖玻片。

1. 在组织培养罩，放置在一个适当大小的孔板的无菌盖玻片。
   
   
2. 大衣与层粘连蛋白细胞粘附的盖玻片。在10微克/毫升无菌水的聚D -赖氨酸（PDL）在室温下5分钟的孵育盖玻片。在20微克/毫升层粘连蛋白在EMEM，4小时，或隔夜取出盖玻片PDL和孵化，在37℃组织培养箱内培养。
   
   
   
   1. 注 :请参阅的传代人类神经干细胞的文章（ https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 ）和点票人类神经干细胞的文章（ https://www.jove.com /指数....

讨论

这一协议描述为hNSPCs的免疫程序，最大限度地减少了所需的抗体量，并提供可靠的的细胞染色。所描述的程序是最好的细胞内的抗原，但可以修改染色细胞表面的分子或增强细胞骨架的染色。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
德国玻璃（Deutsche Spiegelglas）盖玻片	工具	Carolina Biological	WW-63-3029	提供 12、15、18、22、25 mm 盖玻片
Liquinox 无磷酸盐洗涤剂	试剂	Sigma-Aldrich	Z273279	非常黏稠
聚-D-赖氨酸氢溴酸盐	试剂	Sigma-Aldrich	P7280
天然小鼠层粘连蛋白	试剂	Invitrogen	23017-015
EMEM (1X)	试剂	Mediatech, Inc.	MT-10-010-CV	由 Fisher 以所示目录号分销
24 孔板	工具	Fisher Scientific	08-772-1
曲拉通 X-100	试剂	Fisher Scientific	BP151-500	非常黏稠
多聚甲醛	试剂	Sigma-Aldrich	P6148	潜在致癌物，使用粉末和溶液时需谨慎
无 IgG 牛血清白蛋白	试剂	Jackson ImmunoResearch	001-000-161
H–chst 33342	试剂	Invitrogen	H-1399
Vectashield	试剂	Vector Laboratories	H-1000	黏稠