免疫细胞化学是一种强大的方法，用于确定培养细胞中目标抗原的存在、亚细胞定位以及相对丰度。本方案提供了一系列简单易行的步骤，帮助使用者节约抗体并最大限度地优化染色效果。
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摘要
摘要
免疫细胞化学是一种非常强大且相对简单的方法，用于确定培养细胞中目标抗原（最常见的是蛋白质）的存在、亚细胞定位以及相对丰度。本方案提供了一系列易于操作的步骤，使研究人员能够在节约一抗和二抗用量的同时，获得高质量、可重复的定性和定量染色数据。该方案有两个方面有助于减少染色所需抗体的用量。首先，细胞培养在放置于组织培养板孔中的小型圆形盖玻片上。固定后，可将带有细胞的盖玻片从培养板孔中取出。进行抗体染色时，将带有细胞的盖玻片倒扣在封口膜上的一小滴抗体溶液液滴上，并用另一片封口膜覆盖，以防止干燥。采用此方法，每个盖玻片（或样本）仅需约 25 μl 抗体溶液。本方案描述了人神经干细胞/前体细胞（hNSPCs）的免疫染色，但也可用于其他多种细胞类型。
方案
第1天：制备德国玻璃盖玻片及接种细胞
注意：德国玻璃盖玻片通常更适用于原代神经干细胞和神经元的培养。我们采用以下清洗方案以提高细胞的黏附和铺展。将盖玻片置于一个小支架中，确保液体能够接触盖玻片的两侧。首先，将盖玻片在1% Liquinox溶液中孵育10分钟，随后用去离子水洗涤3次。确保无皂液气泡残留。接着，将盖玻片在1M HCl中孵育30分钟，再用去离子水洗涤3次。于65°C下过夜干燥盖玻片。将盖玻片转移至玻璃培养皿中，并进行高压灭菌处理以达到灭菌效果。
- 在组织培养超净台中，将无菌盖玻片放入大小合适的 孔板中。
- 用层粘连蛋白包被盖玻片以促进细胞黏附。将盖玻片置于含10 µg/ml多聚-D-赖氨酸（PDL）的无菌水中，室温孵育5分钟。吸除PDL溶液，再将盖玻片置于含20 µg/ml层粘连蛋白的EMEM培养基中，在37°C组织培养孵箱中孵育4小时或过夜。
- 注意：请参考Passaging Human Neural Stem Cells文章（https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263）和Counting Human Neural Stem Cells文章（https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=262），了解如何重悬和计数hNSPCs。
- 注意：请参考Passaging Human Neural Stem Cells文章（https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263）和Counting Human Neural Stem Cells文章（https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=262），了解如何重悬和计数hNSPCs。
- 用PBS冲洗经层粘连蛋白包被的盖玻片，并以特定密度将细胞接种至每个含有盖玻片的孔中（我们通常对用于免疫染色的细胞采用100,000–300,000个细胞/ml的初始接种密度）。
- 将孔板放入37°C组织培养孵箱中，使细胞贴附于盖玻片（通常至少需要4小时）。
第2天：细胞的固定、通透、封闭及一抗孵育
注意：我们使用以下4%多聚甲醛固定液来保存细胞形态。该配方包含pH转换步骤，以使多聚甲醛充分溶解。我们更倾向于采用此方法而非加热溶解多聚甲醛，因为较高温度可能导致甲酸生成，从而在使用荧光染色时增加背景信号。固定液中的某些组分有助于维持细胞骨架结构（MgCl2 和 EGTA），而其他组分则有助于保持整体形态（蔗糖）。
用于细胞的4%多聚甲醛固定液
| 试剂与步骤： | 配制 100 mL 固定液所需用量： |
| MilliQ 水 | 75 ml |
| 多聚甲醛（在通风橱中称量） | 4 g |
| 10N NaOH，搅拌并逐滴加入直至溶液澄清 | 按需添加 |
| 10X PBS | 10 ml |
| 1M MgCl2 | 0.5 ml |
| 0.5 M EGTA | 2 ml |
| 蔗糖 | 4 g |
| 6N HCl，滴定至 pH 7.4 | 按需添加 |
| MilliQ 水 | 加至 100 ml |
| 4°C 保存，最多可保存 1 周。使用前预热至 37°C | |
- 在实验台上移除培养基，加入预热的固定剂。孵育5-15分钟（根据待检测抗原的不同而定，通常使用10分钟）。此步骤及后续步骤均在室温下进行。
- 将固定剂倒入适当的容器中，因为 许多机构将多聚甲醛视为危险废物。用PBS洗涤细胞3次，每次5分钟。移除液体时，注意避免抽吸导致细胞干燥。此外，每次更换溶液前，应提前准备好下一溶液，并在移除覆盖细胞的液体后立即加入新溶液，防止细胞干燥。
- 如果目标抗原位于细胞内，则必须使细胞膜通透，以允许抗体进入。为实现细胞通透化，使用新鲜配制的含0.3% Triton X-100的PBS溶液。由于Triton黏稠，移液时应缓慢操作，并确保去垢剂在加入细胞前已完全溶解于PBS中。通透化处理5分钟后，用PBS洗涤细胞3次，每次5分钟。
- 必须使用封闭剂处理细胞，以防止抗体非特异性结合。我们使用牛血清白蛋白（BSA）作为封闭剂。封闭液的配制方法为：将5% BSA溶解于PBS中（置于摇床或旋转器上，因溶解需要一定时间），然后使用0.45 µm注射器滤器过滤溶液。将细胞在5% BSA/PBS溶液中于室温下封闭1小时。
将一抗（最好针对目标蛋白具有特异性）用1% BSA/PBS（通过5% BSA/PBS稀释配制）稀释至预先确定的浓度。将稀释后的一抗溶液（每25 mm盖玻片30 µl，每18 mm盖玻片20 µl，每12 mm盖玻片15 µl）滴加到铺有Parafilm的玻璃板上。用镊子夹取带有固定细胞的盖玻片，翻转使其细胞面朝下，覆盖在抗体溶液上，使细胞与抗体充分接触。在整体结构上方再覆盖一条Parafilm。4°C条件下孵育过夜。
第3天：洗涤、二抗孵育、核染色与封片
- 小心移除顶部的封口膜条，取出盖玻片，将其翻转后重新放回含有 PBS 的孔板中进行洗涤，确保细胞面朝上。
- 用 PBS 洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟。
- 选择能够识别一抗的二抗。例如，如果一抗来源于兔，则二抗应能识别兔 IgG。同时需注意匹配抗体的同种型（如 IgG、IgM 等）。若使用多种一抗，应确保它们来自不同物种或具有不同同种型，并计划使用带有不同标记物的二抗进行检测。例如，可使用偶联红色荧光染料的抗兔二抗与偶联绿色荧光染料的抗小鼠二抗。将细胞在含 1% BSA 的适当稀释浓度的二抗溶液中避光、室温孵育 2 小时，操作方法与一抗相同（视频中未展示具体步骤）。若二抗保存于甘油溶液中，孵育所需体积可能略大于一抗（每片 25 mm 盖玻片需 40 µl，18 mm 盖玻片需 30 µl，12 mm 盖玻片需 25 µl）。
- 注意：若使用荧光分子标记二抗，则自加入二抗后样品需避免光照。孵育过程应在避光条件下进行，或将培养板用铝箔包裹。
- 注意：若使用荧光分子标记二抗，则自加入二抗后样品需避免光照。孵育过程应在避光条件下进行，或将培养板用铝箔包裹。
- 按照一抗操作所述方法，小心从封口膜上取下盖玻片。用 PBS 洗涤细胞 2 次，每次 5 分钟，随后在 PBS 中加入终浓度为 2 µg/ml 的 Hoechst 核染料进行 1 分钟孵育（如需进行核复染）。若 Hoechst 染料较旧且信号过弱，可适当延长孵育时间和/或提高染料浓度。Hoechst 孵育结束后，用 PBS 洗涤 1 次，每次 5 分钟。
- 应将盖玻片用封片剂封固于载玻片上，以便在显微镜下观察。若使用荧光分子检测二抗，所用封片剂应含有抗荧光淬灭成分。我们通常使用 Vectashield 作为荧光封片剂。在载玻片上滴加适量体积的 Vectashield（每片 25 mm 盖玻片加 12 µl，18 mm 盖玻片加 6 µl，12 mm 盖玻片加 3 µl）。
- 小心拿起盖玻片，用去离子水冲洗背面以去除盐分（来自 PBS）。用无尘纸或纸巾轻轻吸去多余水分，然后将细胞面朝下置于 Vectashield 液滴上。将盖玻片以一定角度缓慢放下，避免产生气泡。在载玻片上标注日期及样品信息。
- 将贴附盖玻片的载玻片置于避光环境中干燥，然后用吸水纸吸去盖玻片边缘多余的 Vectashield。如有需要，可用指甲油密封盖玻片边缘（尤其适用于在倒置显微镜下观察的样品）。我们通常将载玻片保存于 -20°C 冰箱中。
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讨论
本方案描述了一种针对人神经干细胞/祖细胞（hNSPCs）的免疫染色方法，可最大限度减少所需抗体的用量，同时实现可靠的细胞染色。文中所述步骤最适合用于细胞内抗原的染色，但也可稍作修改，以用于细胞表面分子的染色或增强细胞骨架的染色效果。
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致谢
作者谨感谢加州儿童医院橙县研究所国家人类神经干细胞资源中心的 Philip H. Schwartz 博士提供 hNSPC 培养物，以及埃默里大学的 Gary Bassell 博士在石蜡膜染色技术方面的初步指导。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| 德国玻璃盖玻片（Deutsche Spiegelglas） | 工具 | Carolina Biological | WW-63-3029 | 提供 12、15、18、22、25 mm 盖玻片 |
| Liquinox 无磷酸盐洗涤剂 | 试剂 | Sigma-Aldrich | Z273279 | 非常黏稠 |
| 聚-D-赖氨酸氢溴酸盐 | 试剂 | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| 天然小鼠层粘连蛋白（Laminin, natural mouse） | 试剂 | Invitrogen | 23017-015 | |
| EMEM (1X) | 试剂 | Mediatech, Inc. | MT-10-010-CV | 由 Fisher 以所示目录号分销 |
| 24 孔板 | 工具 | Fisher Scientific | 08-772-1 | |
| 曲拉通 X-100（Triton X-100） | 试剂 | Fisher Scientific | BP151-500 | 非常黏稠 |
| 多聚甲醛 | 试剂 | Sigma-Aldrich | P6148 | 潜在致癌物，使用粉末和溶液时需谨慎 |
| 无IgG牛血清白蛋白 | 试剂 | Jackson ImmunoResearch | 001-000-161 | |
| H–chst 33342 | 试剂 | Invitrogen | H-1399 | |
| Vectashield | 试剂 | Vector Laboratories | H-1000 | 黏稠 |
参考文献
- Flanagan, L. A., Chou, J., Falet, H., Neujahr, R., Hartwig, J. H., Stossel, T. P., Filamin, A. Filamin A, the Arp2/3 complex, and the morphology and function of cortical actin filaments in human melanoma cells. J. Cell Biol. 155, 511-518 (2001).
- Flanagan, L. A., Rebaza, L. M., Derzic, S., Schwartz, P. H., Monuki, E. S. Regulation of human neural precursor cells by laminin and integrins. J. Neurosci. Res. 83, 845-856 (2006).
- Flanagan, L. A., Ziaeian, B., Palmer, T., Schwartz, P. H. Immunocytochemical analysis of stem cells. In Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide. Loring, J. F., Wesselschmidt, R. W., Schwartz, P. H. , Elsevier/Cell Press. (2007).
- Marchenko, S., Flanagan, L. A. Passaging Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, (2007).
- Marchenko, S., Flanagan, L. A. Counting Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, (2007).
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