免疫细胞化学：人神经干细胞

摘要

免疫细胞化学是一种强大的方法，用于确定培养细胞中目标抗原的存在、亚细胞定位以及相对丰度。本方案提供了一系列简单易行的步骤，帮助使用者节约抗体并最大限度地优化染色效果。

摘要

免疫细胞化学是一种非常强大且相对简单的方法，用于确定培养细胞中目标抗原（最常见的是蛋白质）的存在、亚细胞定位以及相对丰度。本方案提供了一系列易于操作的步骤，使研究人员能够在节约一抗和二抗用量的同时，获得高质量、可重复的定性和定量染色数据。该方案有两个方面有助于减少染色所需抗体的用量。首先，细胞培养在放置于组织培养板孔中的小型圆形盖玻片上。固定后，可将带有细胞的盖玻片从培养板孔中取出。进行抗体染色时，将带有细胞的盖玻片倒扣在封口膜上的一小滴抗体溶液液滴上，并用另一片封口膜覆盖，以防止干燥。采用此方法，每个盖玻片（或样本）仅需约 25 μl 抗体溶液。本方案描述了人神经干细胞/前体细胞（hNSPCs）的免疫染色，但也可用于其他多种细胞类型。

方案

第1天：制备德国玻璃盖玻片及接种细胞

注意：德国玻璃盖玻片通常更适用于原代神经干细胞和神经元的培养。我们采用以下清洗方案以提高细胞的黏附和铺展。将盖玻片置于一个小支架中，确保液体能够接触盖玻片的两侧。首先，将盖玻片在1% Liquinox溶液中孵育10分钟，随后用去离子水洗涤3次。确保无皂液气泡残留。接着，将盖玻片在1M HCl中孵育30分钟，再用去离子水洗涤3次。于65°C下过夜干燥盖玻片。将盖玻片转移至玻璃培养皿中，并进行高压灭菌处理以达到灭菌效果。

1. 在组织培养超净台中，将无菌盖玻片放入大小合适的 孔板中。
   
   
2. 用层粘连蛋白包被盖玻片以促进细胞黏附。将盖玻片置于含10 µg/ml多聚-D-赖氨酸（PDL）的无菌水中，室温孵育5分钟。吸除PDL溶液，再将盖玻片置于含20 µg/ml层粘连蛋白的EMEM培养基中，在37°C组织培养孵箱中孵育4小时或过夜。
   
   
   
   1. 注意：请参考Passaging Human Neural Stem Cells文章（https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263）和Counting Hum....

讨论

本方案描述了一种针对人神经干细胞/祖细胞（hNSPCs）的免疫染色方法，可最大限度减少所需抗体的用量，同时实现可靠的细胞染色。文中所述步骤最适合用于细胞内抗原的染色，但也可稍作修改，以用于细胞表面分子的染色或增强细胞骨架的染色效果。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
德国玻璃盖玻片（Deutsche Spiegelglas）	工具	Carolina Biological	WW-63-3029	提供 12、15、18、22、25 mm 盖玻片
Liquinox 无磷酸盐洗涤剂	试剂	Sigma-Aldrich	Z273279	非常黏稠
聚-D-赖氨酸氢溴酸盐	试剂	Sigma-Aldrich	P7280
天然小鼠层粘连蛋白（Laminin, natural mouse）	试剂	Invitrogen	23017-015
EMEM (1X)	试剂	Mediatech, Inc.	MT-10-010-CV	由 Fisher 以所示目录号分销
24 孔板	工具	Fisher Scientific	08-772-1
曲拉通 X-100（Triton X-100）	试剂	Fisher Scientific	BP151-500	非常黏稠
多聚甲醛	试剂	Sigma-Aldrich	P6148	潜在致癌物，使用粉末和溶液时需谨慎
无IgG牛血清白蛋白	试剂	Jackson ImmunoResearch	001-000-161
H–chst 33342	试剂	Invitrogen	H-1399
Vectashield	试剂	Vector Laboratories	H-1000	黏稠