在哺乳动物系统中常用的程序性细胞死亡检测方法，如DNA梯状条带分析或TUNEL检测，通常在植物中难以重复。结合GUS报告系统，我们提出一种快速的基于植物的瞬时检测方法，用于分析特定基因潜在的致死特性。
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摘要
摘要
我们开发了一种新型的瞬时植物表达系统，可同时表达报告基因β-葡萄糖醛酸糖苷酶（GUS）以及细胞死亡的潜在正向或负向调控因子。在该系统中， N. benthamiana 叶片通过共浸润法同时转入含有待分析基因的35S启动子驱动表达盒以及GUS载体pCAMBIA 2301 农杆菌 以菌株LBA4404作为载体。由于GUS表达需要活细胞才能发生，因此当该报告基因与促细胞死亡的正向调控因子共表达时，GUS活性会降低。同样，与空载体对照相比，当共表达抗凋亡基因时，GUS活性会增强。如下所示，我们在实验室中已成功利用该系统分析了促死亡和抗死亡因子，包括植物抗凋亡Bcl-2相关athano基因（BAG）家族成员，以及已知的哺乳动物细胞死亡诱导因子如BAX。此外，我们还利用该系统分析了特定蛋白截短片段的死亡功能，这可能为这些蛋白的潜在翻译后修饰或激活机制提供线索。本文介绍了一种快速且灵敏的基于植物的实验方法，可作为研究特定基因死亡功能的初步手段。
方案
Nicotiana benthamiana 植物在25°C的温控培养室中生长。使用3至6周龄植株的完全展开的健康叶片。
提示：使用新长出的叶片可获得更好的结果
1. 农杆菌瞬时侵染实验方案：
第1天
- 用含有目的基因（用于检测细胞死亡）的载体以及含有组成型启动子驱动的GUS表达盒的载体，对含有利福平（25 μg/ml）和卡那霉素（100 μg/ml）的LB琼脂平板进行农杆菌（Agrobacterium tumefaciens，菌株LBA4404）甘油菌划线接种。务必设置空载体作为阴性对照。
- 在28°C下培养2天。
第3天
- 从先前划线接种的 LB/利福平/卡那霉素平板上，挑取单菌落，接种于 2 ml 含利福平（25 μg/ml）和卡那霉素（100 μg/ml）的 LB 培养基中。
- 将每种培养物在 28°C、200 rpm 条件下振荡培养 24 小时，直至达到最大生长密度。
提示：有时会观察到结块现象，此时在继续操作前需将培养物充分重悬（例如通过反复吹打）。
第4天
- 孵育结束后，加入新鲜的LB培养基（含有适当的抗生素）和乙酰丁香酮，将总体积调至10 mL（乙酰丁香酮终浓度为25 μM）。
- 将每种培养物在28 °C下振荡培养16小时。
第5天
- 次日，用10 ml浸润培养基（10 mM MgSO4·7H2O，9 mM MES，pH 5.6）洗涤每种菌液两次（不要添加乙酰丁香酮），每次洗涤后在室温下以4000 × g离心10分钟。
- 最后一次离心后，将每种菌液重悬于5 ml含有乙酰丁香酮（100 μM）的浸润培养基中。
- 测定OD600nm，OD值在0.1至0.9之间均可接受。
提示：OD600nm低至0.1时也可正常使用，但较高的OD值可能产生更一致的结果。 - 将菌液继续孵育3小时，以准备用于感染的农杆菌菌液。
- 将含有待分析基因的菌液与阴性对照（含空载体的农杆菌）按1:1比例与含有GUS报告基因盒的菌液混合。
- 使用1 ml无针头注射器浸润植物新生叶片的远轴面（下表面）（图1）。
提示：在同一植株的不同叶片上分别浸润阴性对照混合液（空载体 + GUS报告基因盒）和待检测基因的混合液（基因x + GUS报告基因盒）。每种处理使用三株重复植株。 - 浸润后3天，切除浸润过的叶片，检测GUS蛋白的表达。
2. 组织化学GUS检测
第8天
- 将X-gluc底物培养基真空浸润至切除的叶片中。
- 在室温下避光孵育过夜，或直至出现明显的蓝色染色。
第9天
- 用蒸馏水冲洗。
- 在70%乙醇中孵育，直至叶绿素被去除，然后再次转移至蒸馏水中。通过肉眼评估GUS表达水平。
3. 荧光MUG检测法：
第8天
- 使用液氮在研钵中研磨浸润的叶片圆片，以分离总蛋白。在保持样品处于冰上的同时，加入100 μL GUS提取缓冲液（50 mM NaPi pH 7.0，10 mM EDTA，0.1% Triton X-100，0.1% N-月桂酰肌氨酸钠盐，β-巯基乙醇（0.7 μL/mL））。
- 在4 °C下以14,000 g离心悬浮液5分钟，并取上清液作为总可溶性蛋白。
- 根据制造商说明书，使用NanoDrop测定蛋白浓度。
- 使用GUS提取缓冲液将每个样品的蛋白浓度调整至100 μg总可溶性蛋白。
- 加入用GUS提取缓冲液配制的MUG底物（4-甲基伞形基-β-D-葡萄糖醛酸三水合物），使其终浓度为2 mM。每个样品的总体积（蛋白 + MUG底物）达到100 μL即可。
- 在37 °C下孵育反应1小时。
- 通过加入800 μL GUS终止缓冲液（0.2 M Na2CO3）终止反应。
- 使用酶标仪在激发波长365 nm、发射波长455 nm条件下测定荧光强度，并将测定值与MU标准曲线进行比较。GUS活性以nmol MU / μg总可溶性蛋白 / min表示。
4. 储备液与溶液：
- 乙酰丁香酮（1 M）储备液 (FW = 196.2 g) – 将 0.981 g 溶于 5 mL DMSO 中
- 卡那霉素（100 mg/mL）储备液 – 溶于 dH2O 中配制 – 过滤除菌
- 利福平（25 mg/mL）储备液 – 溶于 DMSO 中配制
- LB 液体培养基（1 L）：
1 %（w/v）胰蛋白胨，10 g
0.5 %（w/v）酵母提取物，5 g
170 mM 氯化钠，10 g
pH – 7 - 乙酰丁香酮（25 μM）= 1 mL 最终体积中加入 25 μL 的 1 M 储备液
- 侵染缓冲液（1 L）：
10 mM MgSO4·7H2O (FW = 246.48 g)，2.4648 g
9 mM MES (FW = 213.25 g)，1.91925 g
pH – 5.6 - 乙酰丁香酮（100 μM）= 1 mL 最终体积中加入 100 μL 的 1 M 储备液
- GUS 提取缓冲液
50 mM NaPi pH 7.0，10 mM EDTA，0.1 % Triton X-100，0.1 % N-月桂酰肌氨酸钠，β-巯基乙醇（0.7 μL/mL） - 2× 磷酸缓冲液
0.2 M NaH2PO4 和 0.2 M Na2HPO4，pH 7 - X-Gluc 底物溶液
将 1 mg 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖苷酸（X-Gluc）溶于 0.1 mL 甲醇中。加入 1 mL 2× 磷酸缓冲液、20 μL 0.1 M 铁氰化钾、10 μL 10 % Triton X-100 和 850 μL 蒸馏水。
5. 代表性结果：
按照本方案，当细胞死亡发生时，预期会出现GUS表达的丧失。我们已同时表达了报告基因β-葡萄糖醛酸酶（GUS）与一种细胞保护性蛋白成员 拟南芥 Bcl-2 相关死亡促进因子（BAG）家族。我们进行了共浸润 N. benthamiana 使用由35S启动子驱动的BAG表达盒和GUS载体pCAMBIA 2301的叶片 农杆菌 菌株LBA4404。如图2所示，经此侵染后GUS染色明显增强。相反，当使用Bcl-2家族中已知的促凋亡成员BAX时，GUS染色显著减弱（图2）。在这两种情况下，GUS表达均明显不同于对照组。然而，当表达差异较不明显时，可进行荧光定量MUG检测以精确测定GUS表达水平。
图1. 使用1 ml无针头注射器对N. benthamiana叶片的远轴面进行Agrobacterium菌液渗透的示例。
图2. 在N. benthamiana叶片中，GUS载体与抗死亡基因及已知的细胞死亡诱导因子共同表达。将GUS表达水平与空载体对照组（GUS对照）进行比较。
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讨论
在植物中使用哺乳动物系统中常见的细胞死亡检测技术往往较为困难。结合GUS报告系统，我们提出了一种基于植物的、灵敏的细胞死亡相关因子检测与分析方法。该方法利用了一个简单的原理：只有活细胞才能进行GUS表达。为了确保结果的可靠性和可重复性，携带GUS表达盒和待测基因的菌液必须以相等比例共注射。在比较其他潜在的细胞死亡相关因子时，也应保持这一比例。如上所示，我们在实验室中已成功应用该方法研究了多个基因的潜在致死功能。由于该方法操作简便，我们相信其可常规用于检测细胞死亡调控因子。此外，该方法还可调整以适应在单一体系中同时共表达多个基因。在某些情况下，特定基因的细胞死亡功能依赖于其他程序性细胞死亡效应因子对其的激活或抑制，因此可在含有GUS表达盒的单一体系中共同表达多个基因，以探究此类可能性。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 利福平 | VWR international | IC19549001 | 25mg/mL DMSO 储液 |
| 4’-羟基-3’,5’-二甲氧基苯乙酮（乙酰丁香酮） | VWR international | TCD2666 | DMSO 中 0.981 g/mL（1M 储液） |
| 2-(4-吗啉基)乙磺酸一水合物（MES） | VWR international | EM-6110 | 水中 1.92 g/L，用于配制 1 L 浸润培养基 |
| 胰蛋白胨 | Fisher Scientific | BP1421-2 | 水中 10g/L，用于配制 1 L LB 培养基 |
| 酵母提取物 | VWR international | EM1.03753.0500 | 水中 5g/L，用于配制 1 L LB 培养基 |
| 氯化钠 | VWR international | EM-7710 | 水中 10g/L，用于配制 1 L LB 培养基 |
| 磷酸二氢钠一水合物 | VWR international | MK-7868-12 | 水中 2.5g/L，用于配制 50mM NaPi 缓冲液 |
| 磷酸氢二钠七水合物 | VWR international | EMD-SX0715-1 | 水中 5g/L，用于配制 50mM NaPi 缓冲液 |
| 七水合硫酸镁 | VWR international | EM-MX0070-1 | 水中 2.5 g/L，用于配制 1 L 浸润培养基 |
| N-月桂酰肌氨酸 | VWR international | TCL0151-500G | GUS 缓冲液中 0.1% v/v |
| 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖醛酸环己胺盐（X-gluc） | Gold Biotechnology | G1281C | 甲醇（100%）中 1mg/100μL |
| 4-甲基伞形基-μ-D-葡萄糖醛酸水合物（MUG） | Sigma-Aldrich | M5664 | GUS 提取缓冲液 100 μL 中含 2 mM |
| 三水合亚铁氰化钾 | VWR international | EM-PX1460-1 | X-gluc 底物溶液用 100mM 储液 |
| β-甲基伞形酮（MU） | Sigma-Aldrich | M1381 | MU 标准曲线使用 GUS 提取缓冲液 |
| 碳酸钠 | VWR international | EM-SX0395-11 | 水中 0.2 M，用于配制 GUS 终止缓冲液 |
参考文献
- Jefferson, R. A. GUS fusions: , β-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6, 3901-3901 (1987).
- Nishihara, M. Expression of the β-Glucuronidase Gene in Pollen of Lily (Lilium longiflorum), Tobacco (Nicotiana tabacum), Nicotiana rustica, and Peony (Paeonia lactiflora) by Particle Bombardment. Plant Physiol. 102, 357-357 (1993).
- Hodal, L. Plant Science. 87, 115-115 (1992).
- Kabbage, M. The BAG proteins: a ubiquitous family of chaperone regulators. Cell Mol. Life Sci. . 65, 1390-1390 (2008).
- Kang, C. H. AtBAG6, a novel calmodulin-binding protein, induces programmed cell death in yeast and plants. Cell Death Differ. 13 (1), 84-84 (2006).
- Yan, J. Plant Science. 165 (1), 1-1 (2006).
- Takayama, S., Reed, J. C. Molecular chaperone targeting and regulation by BAG family proteins. Nat Cell Biol. 3 (10), 237-237 (2001).
- Takayama, S. Cloning and functional analysis of BAG-1: a novel Bcl-2-binding protein with anti-cell death activity. Cell. 80 (2), 279-279 (1995).
- Vitha, S. Quantitative β-glucuronidase assay in transgenic plants. Biol. Plant. 35, 151-151 (1993).
- Otha, S. Construction and Expression in Tobacco of a β-Glucuronidase (GUS) Reporter Gene Containing an Intron Within the Coding Sequence. Plant Cell Physiol. 31, 805-805 (1990).
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