在脉动流生物反应器中培养的、带有血管平滑肌细胞的弹性 PGS 支架，可能在相对较短的培养周期内生成具有天然细胞外基质分泌能力的小直径动脉结构。
本文内容
摘要
摘要
心血管疾病是美国主要的死亡原因之一，尤其是冠状动脉疾病，其发病率随着人口老龄化和肥胖率上升而增加1。目前，使用自体血管、同种异体移植物和合成移植物的旁路手术是常用的动脉替代方案2。然而，当动脉内径小于6 mm时，这些移植物的应用受到限制，原因包括供体来源有限、血栓形成并发症、顺应性不匹配以及晚期内膜增生3,4。为克服这些局限性，组织工程技术已被成功应用于开发小直径动脉构建物，这类构建物具有抗血栓性、结构坚固且顺应性良好，是一种极具前景的替代方案。多项先前研究已开发出具有三层结构、优异力学性能和爆破压力接近天然动脉的小直径动脉构建物5,6。尽管通过刚性材料或细胞片支架促进胶原蛋白生成可提高拉伸强度和爆破压力，但这些构建物的弹性蛋白生成量仍较低，顺应性不足，这是导致植入后移植物失效的主要问题。鉴于上述问题，我们提出假设：将具有弹性的生物材料与力学刺激相结合，可更有效地向血管细胞传递弹性及力学信号，从而促进细胞外基质的生成并支持细胞定向排列。
本报告的目的是介绍一种用于动脉组织工程的多孔管状支架制备技术以及对其进行动态力学刺激的方法。我们采用可生物降解的弹性体聚癸二酸甘油酯（PGS）7，通过盐融合法制造多孔管状支架。将成年食蟹猴原代平滑肌细胞（SMCs）接种于支架内腔，并在我们设计的脉动流生物反应器中培养3周。PGS支架具有均匀的厚度，且宏观和微观孔隙呈随机分布。脉动流生物反应器提供的力学刺激促进了平滑肌细胞的定向排列，并增强了支架中的细胞外基质（ECM）分泌。结果表明，弹性体支架结合生物反应器培养中的力学刺激，可能是动脉组织工程中一种具有前景的技术方法。
方案
1. 管状支架的制备
- 准备玻璃管（长度 = 70 mm，外径 = 9.0 mm，壁厚 = 1.0 mm；Small Parts，Miramar，FL）作为支架的模具。
- 通过将 100 mg 透明质酸（HA）溶解于 10 ml 去离子水中，制备 1.0 wt/vol % 的透明质酸（HA）溶液（Sigma-Aldrich，St. Louis，MO）。使用旋转仪混合过夜，直至溶液中无气泡。
- 将 1.0 % HA 溶液倒入玻璃管顶部，使其沿模具内壁缓慢流下。当溶液到达模具底部时，使用旋转仪翻转玻璃管，并重复此步骤，直至模具内壁被溶液均匀涂覆。
- 涂覆完成后，将所有玻璃管置于 37°C 真空烘箱中干燥 24 小时。
- 研磨并过筛用作致孔剂的盐颗粒（粒径 = 25–32 μm）。
- 按照先前所述方法8，组装一根内部涂有 1.0 % HA 溶液的玻璃管、芯轴（外包 PTFE 套管的不锈钢芯）、热缩（HS）套管和 PTFE 环。
- 使用刮刀通过硅橡胶漏斗将所需粒径的盐颗粒加入玻璃模具中。轻轻敲击模具以确保盐颗粒分布均匀。用刮刀侧面刮去模具顶部多余的盐颗粒。
- 在转移装有盐的模具前，提前 30 分钟开启杂交孵育箱。关闭杂交孵育箱后，将装有盐的模具放入其中进行盐融合。
- 从杂交孵育箱中取出模具，并置于 37°C 真空烘箱中干燥 24 小时。
- 从真空烘箱中取出装有盐的模具，使其在室温下冷却。通过按压 PTFE 环将不锈钢芯轴推出以取出芯轴。若芯轴与模具过紧，可使用尖嘴钳将其拉出。从模具底部取下 PTFE 环。
- 将模具放入 120 °C 烤箱中加热 5 分钟，使 HS 套管收缩。检查 HS 套管是否已完全收缩。从装有盐的模具上取下 HS 套管，并使其在室温下冷却。将模具保存于干燥器中，直至使用。
- 通过将 3 g PGS 溶解于 15 ml 四氢呋喃（THF）（Sigma-Aldrich，St. Louis，MO）中，制备 20 wt/vol % 的 PGS 溶液。
- 在通风橱中使用移液勺逐滴将 PGS 溶液加入装有盐的模具腔内。将玻璃模具倾斜约 45°，并在缓慢旋转模具的同时滴加 PGS 溶液至内腔。检查 PGS 溶液是否沿模具壁向下流动。若观察到干燥区域，需添加更多溶液。
- 加入 PGS 溶液后，将模具置于通风橱中至少 30 分钟，以蒸发 THF。
- 将模具放入真空烘箱中，在 100 mTorr 和 150°C 条件下进行预定时间的固化（例如 24 / 36 / 48 小时），以完成 PGS 固化。
- 固化完成后，取出模具并置于室温下冷却。缓慢以垂直方向将每个模具浸入去离子水中。切勿快速浸入，以免气泡导致支架撕裂。
- 小心将模具转移至水浴中，并使用硅胶管将其倾斜放置 1 小时，以便 HA 更易溶解。检查 HA 是否已从模具中溶解。若无 HA 释放，可使用刮刀缓慢推动支架一端使其脱离模具。在支架另一端重复此操作，并在水浴中缓慢来回摇动模具。检查支架是否已在模具内移动。
- 小心将支架转移至另一个带搅拌器的水浴中。切勿用力抓握支架，以免造成破裂。将支架置于水浴中至少 3 天，并定期更换水，以浸出盐颗粒。
- 浸出盐颗粒后，将每个支架转移至装有去离子水的 15 ml 离心管中，并将其置于干冰盒中冷冻 1 小时。将离心管放入冷冻干燥机中（所有管盖必须打开），冷冻干燥 2 天。
- 在使用前，将所有支架存放于干燥器中。
2. 细胞接种用支架的制备
- 从干燥器中取出支架，将其切割为25-30毫米长度。
- 准备两个硅橡胶塞（直径 = 20 毫米，壁厚 = 6.35 毫米，中间孔直径 = 3 毫米），并将两根PTFE管（外径 = 3.97 毫米，内径 = 2.38 毫米，壁厚 = 0.79 毫米，长度分别为60 毫米和40 毫米）分别穿过每个塞子的中间孔。
- 将一段热缩管（HS环）切割为1.5毫米长度，并套在支架一端的顶部。将一根已连接硅橡胶塞的PTFE管尽可能小地重叠插入支架的一端。
- 将支架和PTFE管放入120 °C的烘箱中加热10分钟，使HS环收缩。检查HS环是否已收缩，并确认支架是否牢固连接在PTFE管上。
- 取出支架和PTFE管，置于室温下冷却。将支架-PTFE管组件插入聚碳酸酯管（外径 = 15.5 毫米，内径 = 9 毫米，长度 = 50 毫米）中，作为生物反应器腔室。
- 参照步骤2.3）和2.4）的方法，将另一根PTFE管连接至支架的另一端。
- 调整两个硅橡胶塞，使其内表面紧贴聚碳酸酯管的两端。将硅橡胶塞的外表面分别贴合在两块铝合金板（顶部和底部；宽度 = 20 毫米，长度 = 70 毫米，厚度 = 6.35 毫米）上。将两根螺纹杆插入板的侧孔，并通过拧紧板上的手拧螺母将聚碳酸酯管（包括内部支架）固定在板上。
- 测量每个支架的可接种长度（两个HS环之间的长度），并计算每个支架的内表面积（π × 内径 × 可接种长度），用于细胞接种。
- 用铝箔包裹一个生物反应器腔室单元，并在120 °C下高压灭菌30分钟。将生物反应器的各个部件（培养基储液器、泵管、气体交换器、管路接头和针阀）分别在120 °C下高压灭菌30分钟，并在细胞培养超净台内进行组装。
- 使用蠕动泵在流动回路中以1.0 ml/min的流速，依次进行一系列灌注处理并冲洗支架：70%、50%和25%乙醇各1小时，磷酸盐缓冲液（PBS；Mediatech, Herndon, VA）冲洗2小时，平滑肌细胞（SMC）培养基灌注24小时。
3. 细胞接种与培养
- 从幼年雄性狒狒（Papio Anubis）的颈动脉中分离原代动脉平滑肌细胞（SMCs），并在传代和接种前按照先前所述方法在二维（2D）培养条件下对其进行表征9。
- 使用MCDB 131培养基（Mediatech，Herndon，VA），添加10%胎牛血清（Lonza，Walkersville，MD）、1% L-谷氨酰胺（Mediatech）、50 μg/ml 抗坏血酸（Fisher Scientific，Fair Lawn，NJ）以及抗生素-抗真菌素溶液（10,000 IU/ml 青霉素、10,000 μg/ml 链霉素和25 μg/ml 两性霉素B；Mediatech）扩增SMCs。
- 将生物反应器的每个腔室从生物反应器的流动回路中拆下。在切断外腔（入口）和内腔（出口）流体后，用5 ml注射器将SMCs（第4–6代）以2×106 个细胞/cm2的密度接种至支架的腔内。
- 将所有生物反应器腔室放入37 °C的杂交孵育箱中，并以2 rpm转速旋转4小时，使细胞在支架内均匀分布。
- 从杂交孵育箱中取出生物反应器腔室，在生物安全柜中重新连接至生物反应器的流动回路，并将整个生物反应器系统转移至细胞培养孵育箱中。
- 将泵管（内径 = 1.6 mm）连接至蠕动泵的滚轮上，并在储液瓶中加入新鲜培养基。启动跨壁灌注（从内腔至外腔），流速为1.0 ml/min，持续15分钟，随后仅维持内腔流动。
- 从第1天起逐步增加流速和压力，从1.0 ml/min（内腔剪切应力：1.1 dynes/cm2）和20 mmHg，逐渐增至第21天的14.2 ml/min（15.3 dynes/cm2）和120 mmHg。在第4天更换泵管（内径 = 3.2 mm），并每周更换一次培养基。
4. 组织收获与分析用样品制备
- 经过21天培养后，停止泵的运行，并夹闭培养基储液器的管路（进口和出口）。将蠕动泵的泵管从软骨装置上拆下，并将生物反应器系统转移至超净台中。
- 夹闭每个生物反应器腔室的进液和出液管路，并将其从流动回路中拆下。打开进液管路，在出液管路末端放置一个培养皿以收集聚碳酸酯管内的培养基。缓慢打开出液管路，将腔室内的培养基排出。
- 从腔室上拆下外腔测压针和内腔硅胶管，并通过松开手拧螺钉拆下铝板。取出聚碳酸酯管，并将组织构建物的一端从聚四氟乙烯（PTFE）管上分离。
- 准备一个含有10 ml磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿，将构建物的另一端从PTFE管上拆下。将构建物放入PBS中，清洗三次。
- 用剃刀将构建物切成5 mm长度的片段。如需进行生化分析，则将其置于-80 °C冰箱中冷冻；如需进行力学测试，则转移至含有5 ml新鲜培养基的15 ml离心管中；如需进行组织学或免疫荧光染色，则迅速冷冻于Tissue-Tek最佳切割温度化合物（Sakura Finetek Inc., Torrance, CA）中。
5. 典型结果：
采用可生物降解的弹性体通过盐融合法制备管状 PGS 支架（图 1A）。每个生物反应器腔室均可为支架提供管腔内和管腔外的双向流体流动，并可从主循环回路中作为独立单元拆卸（图 1B）。该生物反应器系统通过控制和监测流速及压力，可同时培养四个支架（图 1C & D）。
生物反应器培养的示意图见图2。接种平滑肌细胞后，每个生物反应器腔室在37 °C下旋转4小时，以使细胞在支架管腔内均匀分布。随后，对支架施加脉动流，持续至第14天，流速（图2A）和压力（图2B）逐步增加。第14天后，流速和压力保持恒定，直至培养结束（第21天）。
采用扫描电子显微镜（SEM）观察PGS支架的表面形貌。扫描电子显微照片显示，支架具有均匀的壁厚（539 ± 18 μm）（图3A），腔面分布着随机排列的大孔和微孔（图3B）。支架的形态计量参数通过显微计算机断层扫描（micro-CT）及图像分析测定。平均孔径为23.3 ± 3.9 μm，孔连通率为99.4 ± 0.62%，表明所有孔在支架内完全相互连通。通过乙醇置换法测得的孔隙率为75.6 ± 2.7%。
通过扫描电镜观察PGS支架的细胞形态（图4）。多层平滑肌细胞完全覆盖了管腔表面，且其排列方向垂直于血流方向。这些结果表明，脉动流生物反应器提供的力学刺激有助于平滑肌细胞在支架中的定向排列。
通过苏木精-伊红（H&E）染色和弹力蛋白自发荧光检测细胞外基质（ECM）和弹性纤维的存在情况（图5）。H&E染色显示，细胞和ECM蛋白完全覆盖了PGS支架的管腔内表面。弹力蛋白自发荧光也显示，在支架的管腔表面存在周向排列的弹性纤维。PGS支架中ECM蛋白的生成量通过生化检测进行测定。不溶性弹力蛋白和胶原蛋白的含量分别为20.2 ± 9.1 μg/mg组织和6.3 ± 1.9 μg/mg组织。
图1. 支架制备与生物反应器系统。（A）管状支架制备示意图。（B）生物反应器腔室。支架连接聚四氟乙烯（PTFE）管，置于聚碳酸酯管内，并由硅橡胶塞和铝合金板固定。每个腔室具有两条流路：管腔内流路（通过硅胶管）和管腔外流路（通过套管针）。（C）置于培养箱内的生物反应器系统。包括培养基储液瓶、蠕动泵模块、气体交换器、压力传感器、两个歧管（顶部和底部）以及针型阀。（D）置于培养箱外的生物反应器系统。包括压力监测仪、流量控制单元、数据采集系统和计算机。
图2. 生物反应器培养示意图。（A）培养方案。（B）各时间点（第1、4、7和14天）施加的压力曲线。
图3. PGS支架的表面形貌。（A）横截面。（B）管腔。
图4. PGS支架的细胞形态。（A）管腔。（B）45°切割的横截面。两图中的箭头均表示流动方向。
图5. PGS 构建物的组织学与弹性蛋白自发荧光分析。（A）H&E 染色。（B）对应的弹性蛋白自发荧光。L：管腔。放大倍数：40X。比例尺：50 μm。
讨论
本文所述使用可生物降解弹性体的制备技术具有以下几个特点。（1）我们采用透明质酸（HA）作为模具脱模剂。由于HA可溶于水，将模具浸泡于水中后，支架可轻易从玻璃模具上脱离。在本研究中，我们使用了1.0 wt/vol %的HA溶液，因为浓度过低（< 0.5 wt/vol %）时溶液黏度不足，在倾倒至玻璃管表面时会迅速流下。为了实现HA溶液的均匀涂覆，当溶液流至玻璃管底部时，我们将玻璃管翻转，并重复此步骤。这种HA涂层对于最终支架的脱模过程至关重要。（2）我们使用热缩套管（HS）来固定玻璃管内的盐颗粒。由于盐颗粒紧密填充在玻璃管内壁与HS套管之间的空间中，因此在移除管底的芯轴和聚四氟乙烯（PTFE）环后，HS套管仍能有效固定盐颗粒。通过将模具置于120 °C的烘箱中加热5分钟，即可轻松去除HS套管，从而获得管状盐模板。（3）我们采用了盐融合法。众所周知，通过调节融合时间，盐融合法可有效改善孔隙的连通性及材料的力学性能10。此外，由于我们使用了PGS，在浸出过程中盐颗粒形成了大孔结构，而微孔则可能是在PGS固化过程中由甘油挥发产生的蒸汽所形成，正如我们先前所述11。因此，通过调节盐颗粒的尺寸以及PGS的固化条件，该方法有望制备出具有不同宏观与微观结构的多孔管状支架。
生物反应器提供的机械刺激为PGS支架提供了脉动流灌注（最大平均流速 = 14 ml/min，最大剪切应力 = 15.3 dyne/cm2，频率 = 0.5 - 1.7 Hz）以及符合生理条件的压力，从而促进了平滑肌细胞（SMC）的生长与定向排列（图4）。这些结果与先前研究一致，已有报道表明，在该频率和剪切应力下的周期性拉伸可促进SMC增殖12以及细胞外基质（ECM）蛋白的生成13,14。除了SMC的生长与定向排列外，PGS支架在生物反应器中培养3周后还支持了ECM蛋白的生成，尤其是呈周向排列的弹性纤维（图5）。一些将弹性体支架用于小直径动脉构建的研究已证实其具有与天然动脉相当的机械强度和爆破压力15，并利用旋转烧瓶实现了平滑肌细胞在顺应性支架中的快速整合16,17，但这些支架中均未发现弹性纤维。我们的结果表明，生物反应器产生的周期性径向扩张更有效地将机械信号传导至PGS支架中的SMC，这可能促进了弹性蛋白的合成与有序排列。
由于在我们的方法中血管平滑肌细胞是唯一产生细胞外基质蛋白的细胞，因此静息状态的内皮层以及增强的机械强度对于构建临床适用的小直径动脉结构至关重要。我们已报道，在本研究的培养条件和力学刺激下，与平滑肌细胞共培养的内皮细胞能够形成融合的单层结构，并支持表型蛋白的表达9。因此，基于本文所述的方法，下一步应优化共培养实验条件，以提升所构建组织的功能，从而制备出类似于天然动脉、具有抗血栓性、强韧且顺应性良好的动脉结构。
致谢
作者感谢高进博士在聚谷氨酸合成方面的帮助，感谢彼得·克雷波博士在生物反应器设置方面的深入讨论，感谢穆罕默德·埃扎拉布博士和吴伟博士在狒狒颈动脉外植体方面的协助。本研究得到了美国国立卫生研究院资助（R01 HL089658）的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 透明质酸钠盐 | Sigma-Aldrich | H7630 | |
| 四氢呋喃 | Sigma-Aldrich | 401757 | |
| MCDB 131 | Mediatech, Inc. | 15-100-CV | |
| 胎牛血清 | Lonza Inc. | BW14-502F | |
| L-谷氨酰胺 | Mediatech, Inc. | 25-005-CV | |
| 抗坏血酸 | Fisher Scientific | A62-500 | |
| 抗生素-抗真菌剂溶液 | Mediatech, Inc. | 30-004-CI | |
| 磷酸盐缓冲液 (PBS) | Mediatech, Inc. | 21-031-CV | |
| Tissue-Tek 最佳切割温度包埋剂, 4583 | Sakura Finetek | 25608-930 |
参考文献
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