研究细菌病原体侵入宿主细胞的通用实验方案，重点关注 金黄色葡萄球菌 和人内皮细胞。
本文内容
摘要
摘要
本文将介绍我们如何研究细菌病原体Staphylococcus aureus对人源内皮细胞的侵袭过程。该通用实验方案可广泛应用于几乎所有可培养细菌的细胞侵袭研究。我们将重点说明可用于研究侵袭过程中特定环节的实验节点，例如肌动蛋白重排或小窝蛋白（caveolae）的作用。宿主细胞在培养瓶中生长，待准备就绪后接种至含有Thermanox盖玻片的24孔板中。使用盖玻片可便于后续将细胞从孔中取出，从而减少血清蛋白在孔壁沉积所造成的干扰（这些沉积物可能被S. aureus附着）。细菌培养至所需密度后，通过洗涤去除分泌性蛋白（如毒素）。将长满单层的内皮细胞盖玻片转移至新的含新鲜培养基的24孔板中，随后加入细菌。细菌与细胞在37°C、5% CO2条件下共孵育所需时间，对于S. aureus通常为15至90分钟。随后从各孔中取出Thermanox盖玻片，并用PBS浸洗以去除未结合的细菌。若需定量总结合细菌（包括黏附和内化细菌），则将盖玻片转移至含PBS配制的0.5% Triton X-100的新孔中。通过轻柔吹打实现细胞完全裂解，随后对细菌进行连续稀释并涂布于琼脂平板进行计数。若需测定侵入细胞内的细菌数量，则将盖玻片转移至含500 μl添加庆大霉素的组织培养基的孔中，继续孵育1小时以杀灭所有胞外细菌。之后可对盖玻片进行洗涤，裂解细胞，并如上所述通过平板涂布法对细菌进行计数。若实验需要直接观察，盖玻片可进行固定和染色，用于明场、荧光或共聚焦显微镜观察，或制备用于电子显微镜分析。
方案
以下方案将描述金黄色葡萄球菌（S. aureus）对内皮细胞侵袭的研究，但理论上也可用于研究任何可培养细菌的细胞侵袭过程。针对金黄色葡萄球菌（S. aureus）和内皮细胞的特定步骤已予以注明。
1. 细菌的制备
- 在37°C、200 rpm振荡条件下，于10 ml脑心浸液（Brain-Heart Infusion, BHI）肉汤中培养 S. aureus 菌株4–16小时（根据所需生长阶段而定）。这些培养条件适用于 S. aureus，若用于其他细菌可能需要调整。
- 用Dulbecco改良Eagle培养基（Dulbecco's Modified Eagle's medium, DMEM；Invitrogen）洗涤细菌三次：室温下离心（5,000 × g，10分钟），弃去上清液，将菌体沉淀重悬于等体积DMEM中，重复此过程。测定所得细菌悬液的光密度，并根据需要进行调整。对于 S. aureus，我们制备OD600 = 1的悬液，其浓度约为109 cfu ml-1。
2. 内皮细胞培养
- 在 37°C、5% CO2 条件下，使用添加胎牛血清（FBS；10%）和 L-谷氨酰胺（2 mM）的 DMEM 培养内皮细胞系 EA.hy9261。或者，可从瑞士巴塞尔的 Lonza 公司购买混合的原代人脐静脉内皮细胞（HUVECs），并按照制造商说明（Lonza）在内皮基础培养基中培养，该培养基需补充 2% FBS、牛脑提取物（含肝素）、人内皮生长因子和氢化可的松，在 37°C、5% CO2 条件下培养。这些生长条件专属于此类细胞，其他宿主细胞类型可能需要调整培养条件。
- 将内皮细胞在 T75 培养瓶中培养至完全汇合，通过肉眼观察确认。
- 准备用于放置盖玻片的 24 孔板。需使用精细镊子（经火焰灭菌）移动具有一个不透明面和一个光亮面的盖玻片。将盖玻片放入 24 孔板的孔中时，应使不透明面朝上，以利于细胞贴附。
- 用 3 ml 胰蛋白酶-EDTA（0.25%）消化 T75 培养瓶中的细胞，并加入 10 ml 相应的培养基中。
- 将 500 μl 重悬的细胞加入含有 Thermanox 玻璃盖玻片的 24 孔板中。一个完全汇合的 T75 培养瓶所提供的细胞足以用于两个 24 孔板，最终每孔约含 5 × 105 个细胞（在 500 μl 培养基中）。
- 按上述条件孵育 48 小时，并通过倒置光学显微镜确认细胞达到 100% 汇合。
- 将盖玻片在 PBS 中浸洗后，转移至新的 24 孔板中，每孔加入 490 μl 含 10% FBS 的 DMEM。
- 为研究特定代谢过程在细胞侵袭中的作用，可在加入细菌前 1 小时向培养细胞中添加抑制剂，并在实验过程中维持其浓度。例如，为确定肌动蛋白重排在金黄色葡萄球菌（S. aureus）侵袭内皮细胞过程中的作用，可添加 50 μM 细胞松弛素 D；或为研究小窝蛋白的作用，可添加 5 mM 甲基-β-环糊精。
3. 侵袭实验
- 向每孔中加入10 μl洗涤后的细菌（使金黄色葡萄球菌 S. aureus 浓度约为 2 × 107 cfu ml-1），每孔已预先含有经洗涤并铺满内皮细胞单层的盖玻片，以及490 μl含10% FBS的DMEM培养基。
- 在37°C、5% CO2条件下孵育15–90分钟。
- 为测定与细胞结合的细菌总数（包括黏附和内化的细菌），将盖玻片在PBS中浸洗三次，然后转移至新孔中，每孔含500 μl含0.5% Triton X-100的PBS溶液。为确保细胞完全裂解并释放所有内化细菌，使用移液器反复吹打数次，移液枪头应直接对准盖玻片表面。
- 通过将液体悬液（或必要时的稀释液）涂布于TSA平板表面，对细菌进行计数。由于TX-100可裂解多种革兰氏阴性菌，可改用皂苷（saponin）替代2。
- 为测定内化细菌数量，移除含有未结合细菌的各孔培养上清液，替换为500 μl含200 μg ml−1 庆大霉素的DMEM/10% FBS培养基。我们常规使用庆大霉素而非溶葡萄球菌素（lysostaphin），因其成本更低，并允许我们在使用不同类型细菌（如葡萄球菌属和乳球菌属）的实验间切换时无需更改实验方案。
- 将培养板置于37°C、5% CO2条件下孵育60分钟，以杀灭所有胞外细菌。
- 将盖玻片在PBS中洗涤三次，裂解后按上述黏附实验所述方法涂布于TSA平板进行细菌计数。
- 在某些情况下，可选择使用光学显微镜直接观察并计数细菌数量。针对金黄色葡萄球菌 S. aureus 的细胞侵袭实验，应使用溶葡萄球菌素（10 μg ml−1）替代庆大霉素，以物理方式清除胞外细菌。
- 将盖玻片置于溶葡萄球菌素溶液中，在CO2培养箱内37°C孵育20分钟，随后冲洗并用Cytopath（Cellpath）固定。
- 用结晶紫溶液（0.5%，w/v）覆盖盖玻片，染色5分钟。
- 在水中浸洗，自然晾干后封片于载玻片上。可通过光学显微镜定量测定每mm2内皮细胞单层上的细菌数量。
4. 代表性结果：
金黄色葡萄球菌（S. aureus）表面表达的纤连蛋白结合蛋白（FnBPA 和 FnBPB）赋予其侵入内皮细胞的能力。近期研究重新定义了 FnBPA 的纤连蛋白结合结构域3。野生型（WT）S. aureus 8325.4 对内皮细胞具有高效侵袭能力，而缺失 FnBPA 和 FnBPB 的菌株（Δfnb）则表现出显著降低的内化水平（图 1A）。用编码缺失纤连蛋白结合结构域的fnbA 基因质粒（pFnR0）对突变株进行互补，不能促进其侵袭能力（图 1A）。相反，用编码完整fnbA 基因的质粒（pFnBA4）对突变株进行互补，则可使侵袭能力恢复至野生型水平（图 1A）。
FnBPA 在内皮细胞侵袭中的作用也可通过异源表达宿主Lactococcus lactis进行验证。L. lactis（pRM9 9）中质粒编码的 FnBPA 表达与不表达 FnBPA 的对照菌株（CTL）相比，对内皮细胞的黏附能力未显著增强（空条柱，图 1B）。相比之下，表达 FnBPA 的L. lactis对内皮细胞的侵袭水平显著高于不表达菌株（实心条柱，图 1B）。
实验重复进行了四次，每次设两个复孔，数据以均值 ± 标准差表示。* 表示与野生型（WT）或对照组（CTL）相比具有统计学显著差异的数据（p = <0.05）。
图1. EA. Hy926 内皮细胞的侵袭 S. aureus （A）或 L. lactis （B）
讨论
本文所述的实验方法基于庆大霉素保护实验，该方法已被广泛用于研究细菌对宿主细胞的侵袭。早期研究利用了庆大霉素及其他抗生素无法杀灭细胞内细菌的观察结果，以探索细菌对宿主细胞的侵入能力4-8。使用24、48甚至96孔板可在较短时间内以相对较低的成本获得大量定量且可重复的数据。该实验方法还具有无需特殊设备、可针对不同细菌和细胞类型进行调整，并可用于研究细菌和宿主细胞在侵袭过程中各自作用的优点9。事实上，自最初实验以来，庆大霉素保护实验已被广泛应用于测量多种不同细菌甚至细菌组合对宿主细胞的侵袭能力10,11。尽管其核心原理相同，但该方法已有诸多细微的变异版本被报道。本文中我们介绍了我们所采用的实验流程，并指出了在应用于其他细菌或宿主细胞时可能需要进行的修改。在设计使用该方法测量宿主细胞侵袭的实验时，需考虑以下几个重要方面：
细菌对庆大霉素的敏感性。 这一点看似显而易见，但至关重要的是，必须确保所研究的细菌在将要使用的浓度、温度和作用时间内对庆大霉素敏感。如果细菌不敏感，可考虑使用其他抗生素5。另一种替代方法是使用溶菌酶（如溶葡萄球菌素、溶菌素、溶菌酶）12。
孵育与接种量。首次进行此实验时，确定最佳孵育时间及细菌接种量至关重要。因此，初步实验应考察不同时间点（5 分钟至最长 6 小时）的黏附和侵袭情况。同时，还需评估感染复数（MOI；即每个细胞的细菌数量）对侵袭能力的影响。通常应尽可能使用最少数量的细菌，以减少对培养细胞的损伤。若采用过长的孵育时间或过大的接种量，可能会忽略不同菌株之间的重要差异9,13。
细胞损伤。 使用细菌前进行洗涤非常重要。然而，细胞损伤并不仅限于毒素的产生。细菌侵袭、诱导细胞凋亡以及干扰正常的细胞功能均可能导致细胞损伤。这可能导致庆大霉素进入细胞内，杀死已被吞噬的细菌，从而造成细菌未发生侵袭的假象14。
培养条件。 培养温度和培养基成分可能对侵袭过程产生显著影响。例如，Streptococcus pyogenes 对 HeLa 细胞的侵袭依赖于可溶性纤连蛋白的存在，而该蛋白通常存在于血清中15。另一个需要考虑的因素是实验过程中细菌在培养基中的生长情况。
胞内细菌的培养与定量。 尽管TX-100可能不会杀死胞内细菌，但它可能抑制其生长。因此，有必要在固体培养基中检测该去垢剂存在下的细菌复制情况。若发现有影响，可尝试使用较低浓度的去垢剂，或改用皂苷等替代物。与结晶紫染色和显微镜检测法相比，庆大霉素保护法的优势在于操作更省力，并且能够检测和区分被吞噬细菌的不同亚群。例如，S. aureus 可形成正常菌落类型（NCT）或小菌落变体（SCV）16，而单个细菌细胞的显微观察无法区分这两种类型。相比之下，结晶紫染色与显微镜检测法的优势在于可校正细胞聚集现象，并能检测进入“可存活但不可培养”状态的胞内细菌17。
研究宿主细胞过程在细菌入侵中的作用。许多研究采用了宿主细胞功能抑制剂，例如干扰微丝重排的细胞松弛素D（cytochalasin D）。此类研究还可包括靶向细胞表面受体的抗体以及特异性基因的siRNA敲低18。至关重要的是要确保这些处理不会影响培养细胞的活力或贴附能力，也不会对细菌产生毒性作用。
未来方向：
由于该检测通常在多孔细胞培养板中进行，理论上可将其调整用于高通量筛选，例如用于检测可能影响细胞功能的抑制剂、抗感染药物或靶向细胞内细菌的抗生素文库。此外，该方法也可用于筛选突变体文库，以鉴定参与细胞黏附、侵袭或细胞内存活的相关基因。在某些情况下，可能需要在模型系统中引入剪切力（流动），例如在模拟内皮细胞环境时，以更真实地模拟生理条件 体内 环境。在流动池和微流控细胞培养系统的设计与制造方面的最新进展，为在包含剪切力的宿主-病原体模型中应用庆大霉素保护实验提供了可能。
总之，此处所述方案基于多年来使用的类似方法。该方法可广泛适用于多种培养细胞和细菌种类，能够快速且以相对较低的成本产生大量数据。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作由惠康信托基金（WT 0795880）资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM | Invitrogen | 31885-023 | |
| 脑心浸液 | BioChemika | 53286 | |
| F–胎牛血清 | Invitrogen | 10091-148 | |
| HUVECs | Lonza Inc. | CC-2519 | |
| 内皮基础培养基 | Lonza Inc. | CC-3121 | |
| 牛脑提取物（含肝素） | Lonza Inc. | CC-4092 | |
| 人内皮细胞生长因子 | Lonza Inc. | CC-4017C | |
| 氢化可的松 | Lonza Inc. | CC-4035C | |
| GA-1000 | Lonza Inc. | CC-4092C | |
| 庆大霉素 | Invitrogen | 15710 | |
| 溶葡萄球菌素 | AMBI | LSPN-50 | |
| Thermanox 盖玻片 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | TKT-210-330P | |
| 曲拉通 X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Cytopath | TCS Biosciences | HC8595 | |
| 结晶紫 | Sigma-Aldrich | C3886 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| T75 培养瓶 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 430641 | |
| 细胞松弛素 D | Sigma-Aldrich | C2618 | |
| 甲基-β-环糊精 | Sigma-Aldrich | 332615 |
参考文献
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