使用微量生物分光光度计测定核酸和蛋白质的浓度

摘要

本文报道了BioSpec-nano紫外-可见分光光度计在双链DNA和蛋白质定量中的准确性和重复性数据。即使使用极小体积（1至2 µL），其重复性仍非常优异，而自动擦拭功能可提高通量，并将残留降至最低，从而获得更精确的结果。

摘要

核酸定量技术在过去三十年中取得了显著进展。越来越多的分子生物学家在实验中需要对核酸样品进行稳定的小体积分析。BioSpec-nano 通过专用光学系统和高灵敏度的 PDA 检测器，为当前 DNA 定量方法中普遍存在的不准确、不可重复等问题提供了潜在解决方案。此外，BioSpec-nano 具备自动化功能，可由仪器自动完成样品装载、测量和清洗，从而消除了光纤元件手动安装、测量和手动清洗过程中繁琐、重复且不一致的操作。

本研究提供了关于 DNA 和蛋白质定量以及测量重复性和准确性的数据。通过自动样品接触和快速扫描，可在三秒内完成测量，从而实现极高的通量。数据分析通过软件内置功能完成。用于计算 DNA 浓度的公式为：

样品浓度 = DF · (OD260-OD320)· NACF (1)

其中 DF = 样品稀释因子，NACF = 核酸浓度因子。

核酸浓度因子根据所选分析物进行设置¹。

通过输入e280和分子量值，可分别将蛋白质浓度结果表示为μg/mL或mol/L。当在e280Calc标签页中输入Tyr、Trp和半胱氨酸（S-S键）的残基数时，软件将根据公式e280 = 5500 ×（Trp残基数）+ 1490 ×（Tyr残基数）+ 125 ×（半胱氨酸S-S键数）计算消光系数。该e280值将被软件用于浓度计算。

除了可用于测定核酸和蛋白质的浓度外，BioSpec-nano 还可作为超微量分光光度计用于检测许多其他分析物，或使用 5 mm 光程的比色皿作为标准分光光度计。

方案

1. DNA 定量步骤

1. 打开仪器电源。
2. 从电脑桌面启动 BioSpec-nano 软件。
3. 点击软件中的“Simple Nucleic Acid -dsDNA”标签（图1）。
4. 软件将与仪器建立通信并运行初始化程序，以确认仪器性能符合技术规格。
5. 在光程长度滑块上选择 0.7 或 0.2 mm。所选光程将用于所有后续计算。
6. 在 BioSpec-nano 软件中，点击 Setup-Autowiping setup，选择 1 或 2。
7. 用移液器将 2 μL（适用于 0.7 mm 光程）的 H₂O 或缓冲液加样至样品台。
8. 点击“blank”或按 F6 键进行空白测量。每次更换光程长度后，均需重新记录空白值。
9. 用移液器将 2 μL 样品加样至样品台。
10. 在软件中点击“Start”或按下仪器上的启动按钮。上部窗口将下移并与样品液滴接触，可观察到氙灯闪烁。
11. 对同一样品重复测量 3 次，以评估重复性。
12. 所有记录的数据均以 .bud 文件格式保存。
13. 如需保存为 .pdf 或 .csv 文件，请点击“save pdf/csv”或按 F9 键。也可在“保存”选项卡中选择相应格式将结果导出为 .csv 文件。

2. 蛋白质定量方案

1. 选择蛋白质定量选项卡（图 2）。
2. 如果已知，输入 280 nm 处的消光系数 e280。
3. 如果 e280 未知，使用 e280Calc 计算该值。
4. 在光程滑块上选择 0.7 或 0.2 mm。
5. 点击自动擦拭设置（Setup-Autowiping setup），选择 2 或更高数值。
6. 在样品台加入 3 μL（适用于 0.2 mm 光程）H₂O 或缓冲液。
7. 点击“空白”或按 F6 进行空白测量。
8. 在样品台加入 3 μL 蛋白质样品。
9. 在软件中点击“开始”或按下仪器上的启动按钮。
10. 对同一样品重复测量 3 次，以确定重复性。
11. 所有记录的数据均保存为 .bud 文件。
12. 如需保存为 .pdf 或 .csv 文件，请点击保存 pdf/csv 或按 F9。

3. 代表性结果：

1. DNA 定量结果

图3显示了典型双链DNA样品的测量数据，同时给出了计算得到的浓度和OD 260/280比值。图4包含了DNA定量的重复性测试结果。图3和图4的数据表明，结果具有高度可重复性，相对标准偏差仅为0.26%，结果明显可靠。

注1：

DNA 定量不准确可能源于缓冲液组分的存在，这些组分可能在紫外区产生吸收。同时必须使用均一的样品溶液。由于移液量仅为 1–2 μL，因此需要准确移取体积，并避免引入气泡。

2. 蛋白质定量结果

图5展示了BSA的蛋白浓度分析结果。μg/mL蛋白浓度基于e280值测定。图6显示了重复性分析结果。从0.51%的相对标准偏差可以看出，BioSpec-nano不仅对DNA，而且对蛋白质的浓度测定均具有高度精确性。

注2：影响蛋白质浓度的因素

当pH值、缓冲液、温度或添加剂引起的不稳定性影响最小时，可以准确测定蛋白质的浓度。大多数纯化后的蛋白质需经过多种加工步骤，因此可能含有表面活性剂或其他添加剂，这些物质可能会干扰液滴的形成。对于此类样品，强烈推荐使用5 mm光程的石英比色皿。

图 1. 双链 DNA 定量的分析物选择窗口

图 2. 用于无标记蛋白质定量的分析物选择窗口

图3. DNA定量的代表性数据

图 4. DNA 定量的重复性数据

图5. 蛋白质定量的代表性数据

图 6. 蛋白质定量的重复性数据

讨论

BioSpec-nano 旨在解决现有 DNA 定量方法中存在的问题，例如结果不一致和繁琐的手工操作。每次测量仅需 3 秒，经验丰富的分子生物学家每分钟可分析约 3 至 6 个样品。独特的擦拭功能不仅提高了测量通量，还消除了对手动清洁样品台的依赖，使测量之间的残留几乎可以忽略不计。此外，针对浓度为 1000 ng/μL 的 DNA 样品，仅使用两次擦拭的测试结果显示残留量低于 2 ng/μL。

5 mm 光程长度的比色皿可用于分析稀释的核酸和蛋白质样品，从而扩展了该仪器在其他应用中的使用范围。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BioSpec-nano	Shimadzu Corporation
小牛胸腺DNA	Sigma-Aldrich
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich