使用微量的生物规格的纳米分光光度计核酸和蛋白的浓度测定

Summary

这种沟通的BioSpec纳米的紫外 - 可见分光光度计双链DNA和蛋白质定量的准确性和可重复性的数据。即使与超小卷（1〜2 L），重现性优良，自动擦拭功能，同时可以提高吞吐量和更精确的结果最小结转结果。

Abstract

在过去三十年，拥有先进的核酸定量程序明显。越来越多，分子生物学家需要小批量的分析，他们的实验中核酸样品一致。 BioSpec纳米不准确的，非重复性的结果，在当前的DNA定量方法所固有的，通过专门的光学和一个敏感的PDA检测器的问题提供了一个潜在的解决方案。 BioSpec - nano还具有自动化功能，例如，安装，测量和清洁仪器，从而省去繁琐，重复和不一致的光纤元素和手工清洗的位置。

在这项研究中，DNA和蛋白质，以及测量的可重复性和准确性的量化数据呈现。自动样品接触和快速扫描可以在三秒钟内测量，造成出色的吞吐量。使用该软件的内置功能进行数据分析。用于计算DNA浓度的计算公式为:

样品的浓度= DF（OD260 - OD320）·农协（1）

凡DF =样品稀释倍数和农协=核酸浓度的因素。

按照选定¹待测核酸浓度的因素。

可以表示为μg/ mL的蛋白浓度结果或进入E280和分子量值分别为痣/大号。当在e280Calc选项卡中输入的酪氨酸，色氨酸和半胱氨酸（二硫键）的残留值，消光系数的计算值作为E280 = 5500 ×（Trp残基）+ 1490 ×（Tyr残基）+ 125 ×（半胱氨酸二硫键） 。 E280的价值是用浓度计算软件。

BioSpec纳米除核酸和蛋白质浓度测定，可用于许多其他分析超微量分光光度计，或用5毫米光程细胞作为一个标准的分光光度计。

Protocol

1。 DNA定量的程序

1. 打开仪器。
2. BioSpec纳米软件从PC桌面上打开。
3. 点击简单核酸双链DNA标签（图1）。
4. 该软件将建立与仪器的通信和运行初始化序列。这验证，该仪器是按规范进行。
5. 选择0.7或0.2毫米的光程滑块。这种选择的光程，所有的计算都基于所选择的路径长度。
6. BioSpec纳米软件，请点击设置Autowiping设置下一步。选择1或2。
7. 加入2μL（0.7毫米）H _{2 O}或底座上的缓冲区。
8. 点击空白的空白测量或F6。每次选择一个新的光程是要记录一个空白。
9. 加入2μL的样品基座上。
10. 单击"开始在软件或按下仪器上的启动按钮。上面的窗口移动，使样品液滴的接触。氙弧灯可以观察到。
11. 同一样品重复3次，以确定可重复性。
12. 所有的数据记录保存。芽文件。
13. 要保存为PDF或CSV文件。，单击"保存PDF / CSV或F9键。结果也可以保存为。csv文件，使用适当的选择"保存"选项卡。

2。蛋白质定量议定书"

1. 选择蛋白定量选项卡（图2）。
2. 输入消光系数E280，如果知道的话。
3. 如果不知道E280计算使用e280Calc。
4. 选择0.7或0.2毫米的光程滑块。
5. 点击安装Autowiping设置。选择2个或以上。
6. 移取3μL（0.2毫米）H _{2 O}或底座上的缓冲。
7. 点击空白的空白测量或F6。
8. 移取3μL蛋白质样品基座。
9. 单击"开始在软件或按下仪器上的启动按钮。
10. 同一样品重复3次，以确定可重复性。
11. 记录所有的数据将被保存为。芽文件
12. 要保存为PDF或CSV文件。，单击"保存PDF / CSV或F9键。

3。代表性的成果:

1。 DNA定量结果

图3显示了一个典型的双链DNA样本的测量数据。也显示浓度和OD 260/280比值计算。图4包含DNA定量的测试结果的重复性。在图3和图4显示了结果的数据是非常明显低的相对标准偏差为0.26％重复性。

注1:

DNA定量不准确，可能会出现缓冲液成分的存在，这可能在紫外区的吸收。也有必要使用一个同质的样品溶液。由于吸管样本量只有1-2微升，准确卷小心吹打没有出台任何气泡是必需的。

2。蛋白质定量结果

图5表示蛋白质BSA浓度的分析。 μg/ mL的蛋白浓度是基于E280价值。图6显示了可重复性的分析。 BioSpec纳米措施浓度精确 - 不仅对DNA也为蛋白质，这是显而易见的，相对标准偏差为0.51％的。

注2:蛋白质浓度的影响因素

精确的蛋白浓度测定是可行的，当有不稳定的最低pH值，缓冲液，温度，或添加剂造成的影​​响。大多数纯化的蛋白质经过加工的各个步骤，因此它是可能的，该蛋白可能包含表面活性剂或其他添加剂，可能会干扰与液滴的形成。对于这样的样品，用5毫米光程的石英细胞是强烈建议。

图1双链DNA定量的分析物的选择窗口。

图2分析物非标记的蛋白质定量选择窗口。

DNA定量有代表性的数据图3。

图4。重复性DNA定量数据

蛋白质定量的有代表性的数据图5 。

图6。蛋白质定量的重复性数据

Discussion

BioSpec -纳米经过精心设计，以解决目前在DNA定量方法的固有问题，如不一致的结果和繁琐的手工劳动，。每次测量只需3秒，让经验丰富的分子生物学家分析多个样品约3-6分钟。独特的雨刮器功能，不仅提高了测量的吞吐量，同时也消除了手工清洗基座的需要，造成测量之间可以忽略不计结转。此外，测试使用的DNA样本包含1000纳克/μL仅2湿巾，表示结转小于2纳克/μL。

一个5毫米的光程细胞的可用性提供了一个选项分析稀核酸和蛋白样品，并扩展其他应用程序使用此仪器。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BioSpec-nano	Shimadzu Corporation
小牛胸腺 DNA	Sigma-Aldrich
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich