我们描述了一种用于制备微流控装置的方案，该装置可实现细胞捕获与培养。在此方法中，通过在微流控通道内设计具有特定图案的微结构（如沟槽），以形成低剪切应力区域，从而使细胞能够在其中停靠。
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摘要
摘要
我们描述了一种带有微沟槽结构的微流控装置，用于研究细胞行为。该微流控平台由上方的流体通道和下方的微沟槽基底组成。为了制备微沟槽通道，将含有微流控通道印模的上层聚二甲基硅氧烷（PDMS）模具与微沟槽基底对准并键合。利用该装置，小鼠成纤维细胞被固定并排列在不同宽度（25、50、75 和 100 μm）的微沟槽基底中。为在微流控装置中研究细胞凋亡，将含有过氧化氢、Annexin V 和碘化丙啶的培养基灌注到流体通道中，持续 2 小时。我们发现，暴露于氧化应激的细胞发生凋亡。这些凋亡细胞通过 Annexin V 得到确认，因为 Annexin V 可在凋亡过程中结合到细胞质膜外小叶的磷脂酰丝氨酸上。利用带有微沟槽结构的微流控装置，可在含孵育腔（37°C，5% CO2）的倒置显微镜下实时观察并分析细胞凋亡过程。因此，这种集成微沟槽基底的微流控装置可用于研究细胞行为以及进行高通量药物筛选。
方案
A. 微流控装置的微加工
- 将4英寸硅片用反应性氧等离子体处理（30 W，5分钟，Harrick Scientific，纽约）。
- 在硅片上以900 rpm转速旋涂负性光刻胶（SU-8 2015，Microchem，马萨诸塞州），持续1分钟。
- 将硅片置于热板上于95°C预烘6分钟，并通过含有微通道的掩膜版用紫外光（200 W）曝光4分钟。
- 硅片在95°C后烘6分钟，并使用SU-8光刻胶显影液进行显影。
- 含有微通道图案的光刻胶图形化硅片被放置于培养皿中。
- 聚二甲基硅氧烷（PDMS）（Sylgard 184）模具通过混合硅弹性体与固化剂（10:1比例）制备。
- 将PDMS混合物倒入硅主模具上，并置于真空干燥器中以去除气泡。
- PDMS在70°C下固化1~2小时。
- 随后将PDMS模具从硅主模具上剥离下来。
B. 组装装置
- 通过两个不同的硅质母模，分别获得40 µm厚的顶部流体通道和40 µm厚的底部微沟槽通道（宽度分别为25、50、75和100 μm）。
- 对微流控装置的流道入口和出口进行打孔处理。
- 使用反应性氧等离子体（30W，5分钟，Harrick Scientific，NY）将流体通道与微沟槽通道进行不可逆键合。
- 在培养箱（37°C）中孵育1小时，将细胞外基质（ECM）（如纤连蛋白）包被于微流控装置内部。
C. 细胞接种与实验设置
- 使用含10%胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），在组织培养瓶中培养NIH-3T3小鼠成纤维细胞。
- 用胰蛋白酶消化并解离细胞。
- 将解离后的细胞以3×106个细胞/ml的密度接种至微沟槽通道中（图1）。
图1 - 使用注射泵（1 µl/min）将2 mL培养基、100 mM H2O2以及凋亡检测试剂（20 µL Annexin V和40 µL碘化丙啶，Invitrogen，CA）注入通道中。
- 使用倒置显微镜（Nikon TE 2000）对细胞进行实时监测。
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讨论
细胞在微流控装置内的微沟槽基底中被固定并形成特定排列。通过使用Annexin V和碘化丙啶，实时观察并分析了暴露于过氧化氢的细胞的凋亡过程。因此，这种含有微沟槽通道的微流控装置可用于高通量药物筛选。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| PDMS | 试剂 | K.R. Anderson Co. | 2065622 | 聚二甲基硅氧烷，Dow Corning Sylgard 184（8.6 磅） |
| DMEM | 培养基 | Invitrogen | 11965 | Dulbecco’s 修饰 Eagle’s 培养基 |
| FBS | 血清 | Invitrogen | 10082-147 | 胎牛血清 |
| 过氧化氢 | 试剂 | Sigma-Aldrich | H1009 | |
| 细胞凋亡检测试剂盒 | Invitrogen | V13242 | Annexin A，碘化丙啶 | |
| 负性光刻胶 | MicroChem Corp. | SU-8 2015 | ||
| 硅晶圆 | 工具 | 4 英寸硅晶圆 | ||
| 反应性氧等离子体 | 试剂 | Harrick Scientific Products, Inc. | 在 30 W 条件下处理晶圆 5 分钟 | |
| 倒置显微镜 | 工具 | Nikon Instruments | TE 2000 |
参考文献
- Chung, B. G., Park, J. W., Hu, J. S., Huang, C., Monuki, E. S., Jeon, N. L. A hybrid microfluidic-vacuum device for interfacing with conventional cell culture platform. BMC Biotechnol. 7, (2007).
- Khademhosseini, A., Yeh, J., Eng, G., Karp, J., Kaji, H., Borenstein, J., Farokhzad, O. C., Langer, R. Cell docking inside microwells within reversibly sealed microfluidic channels for fabricating multiphenotype cell arrays. Lab Chip. 5, 1380-1386 (2005).
- Whittemore, E. R., Loo, D. T., Watt, J. A., Cotman, C. W. A detailed analysis of hydrogen peroxide-induced cell death in primary neuronal culture. Neuroscience. 67, 921-932 (1995).
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