我们展示了荧光指示剂TMRM在皮层神经元中的应用，用于测定特定刺激前后TMRM荧光强度的相对变化。我们还展示了荧光探针H2DCF-DA的应用，以评估皮层神经元中活性氧的相对水平。
本文内容
摘要
摘要
线粒体膜电位（ΔΨm）对于维持呼吸链的生理功能以生成ATP至关重要。ΔΨm的显著丧失会导致细胞能量耗竭，进而引起细胞死亡。活性氧（ROS）是重要的信号分子，但在病理条件下其积累可导致氧化应激。细胞内ROS的两个主要来源是环境毒素和氧化磷酸化过程。线粒体功能障碍和氧化应激已被认为多种疾病发病机制中的关键因素；因此，检测ΔΨm和ROS的能力可为了解细胞生理状态及线粒体功能提供重要线索。
多种荧光探针（Rhodamine 123、TMRM、TMRE、JC-1）可用于测定多种细胞类型的线粒体膜电位（Δψm），而许多荧光指示剂（Dihydroethidium、Dihydrorhodamine 123、H2DCF-DA）可用于测定活性氧（ROS）。几乎所有用于评估ΔΨm或ROS的现有荧光探针均为单波长指示剂，其荧光强度会随着ΔΨm或ROS水平的升高或降低而相应增强或减弱。因此，必须测量这些探针在基础状态以及施加特定刺激后的荧光强度，以便计算荧光强度从基础水平到刺激后变化的百分比。该荧光强度的变化反映了ΔΨm或ROS相对水平的变化。在本视频中，我们演示了如何在大鼠皮层神经元中应用荧光指示剂TMRM，以测定在基础状态与施加线粒体解偶联剂FCCP后TMRM荧光强度变化的百分比。经FCCP处理后TMRM荧光强度的降低反映了线粒体膜电位的去极化。我们还展示了如何应用荧光探针H2DCF-DA来评估皮层神经元中ROS的水平，先在基础状态下测定，再在施加H2O2后进行测定。该实验方案（经少量修改后）也可用于测定不同类型细胞以及来自其他脑区的神经元中∆Ψm和ROS的变化。
方案
1. 细胞培养
- 采用先前描述的技术分离皮层神经元，并将其接种于涂有聚-D-赖氨酸和层粘连蛋白的玻璃底培养皿（MatTek Corporation, Ashland, MA）中进行培养1。
2. 荧光探针TMRM和H2DCF-DA的储备液配制
- 通过将5.0 mg的TMRM溶解于1 ml无水二甲基亚砜中，配制10 mM的TMRM储备液。涡旋混匀1分钟。然后分装成小份，于-20°C避光保存，并在一个月内使用。
- 接着，通过将4.87 mg的H2DCF-DA溶解于1 ml无水DMSO中，配制10 mM的H2DCF-DA储备液。同样涡旋混匀1分钟。然后分装成小份，于-20°C避光保存，并在一周内使用。
3. 使用 TMRM 和 H2DCF-DA 负载大鼠皮层神经元
TMRM 是一种电位敏感、可穿透细胞膜的荧光探针，能够积聚于电负性极强的线粒体内部。使用低浓度（10–50 nM 范围）的 TMRM 至关重要，以避免线粒体内 TMRM 发生自淬灭。因此，TMRM 的荧光信号可直接反映线粒体内膜上的跨膜电位 ΔΨm。当 ΔΨm 降低时，TMRM 会从线粒体中泄漏，导致荧光强度下降。H2DCF-DA 是一种可穿透细胞膜的探针，进入细胞后被胞内酯酶转化为 DCF-DA，其氧化产物为具有荧光的 DCF。H2DCF-DA 的终浓度通常在 2–10 μM 范围内，但由于高浓度加载可能导致 DCF 荧光饱和（即使在无 H2O2 存在时），因此需根据不同脑区来源的神经元进行经验性优化。任何内源性或外源性氧化剂（如一氧化氮、过氧化氢）的存在均会增强 DCF 的荧光强度。下文提供了将 TMRM 和 H2DCF-DA 加载至大鼠皮层神经元的实验方案。
- 为使大鼠皮层神经元负载TMRM，首先用Tyrode缓冲液（文本叠加：TB：145 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM葡萄糖, 1.5 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 10 mM HEPES, pH 7.4）洗涤培养的神经元3次。2，1 mM MgCl2，以及 10 mM HEPES；用 NaOH 调节 pH 至 7.4）。然后，通过将 10 mM TMRM 原液用 TB 稀释 1000 倍来配制 20 nM 的 TMRM，随后加入 2 μl 每1 ml TB中加入稀释的TMRM。将神经元在室温避光条件下与TMRM孵育45分钟。孵育45分钟后，将培养皿置于显微镜载物台上并开始成像。
- 将大鼠皮层神经元加载H2DCF-DA，用 TB 洗涤培养的神经元 3 次。接下来，准备 2 μM H的2DCF-DA 通过稀释 10 mM H2将 DCF-DA 储存液用 TB 稀释 10 倍，然后加入 2 μl 稀释的H2DCF-DA 每 1 ml TB。然后，将神经元与 H 孵育2在室温避光条件下用 DCF-DA 孵育 45 分钟。孵育结束后，用 TB 洗涤神经元 4 次，以去除多余的荧光探针，随后进行成像。
4. 使用TMRM孵育神经元进行活体成像以测定ΔΨm
- 为对加载了TMRM的神经元进行活细胞成像，使用共聚焦激光扫描显微镜（文本叠加：LSM 510，Carl Zeiss Inc.），并应用实时时间序列程序。采用低分辨率和衰减的激光功率（文本叠加：低分辨率：256 x 256；激光功率：1%），以缩短获取图像所需时间并避免光漂白。
- 接下来，使用反射光调节加载TMRM的固定神经元的焦距。通过514 nm激发光照射，并在570 nm处检测TMRM荧光。将相机的检测增益调节至略低于饱和水平。
- 一旦设定好所有参数，包括分辨率、激光功率、相机检测增益以及获取图像的时间间隔，则在不同实验之间不得更改这些设置。随后切换视野，开始采集图像。
- 为检测ΔΨm的变化，可施加如1 μM FCCP或2 μg/ml寡霉素等刺激物，分别显著去极化或超极化线粒体膜电位。这些变化将反映为TMRM荧光强度相较于基线水平的下降（FCCP情况）或增强（寡霉素情况）。
5. 使用 H2DCF-DA 孵育神经元以检测活性氧的活体成像
- 为了对孵育了 H2DCF-DA 的神经元进行活体成像，首先将培养皿置于显微镜载物台上，使用反射光调节细胞焦距，通过 488 nm 激发光和 515 nm 发射光检测 DCF 荧光信号。
- 接着，将激光功率调整为 5–7%，设定检测器增益和 256 × 256 的分辨率。不同实验之间不得更改这些参数。然后，通过时间序列程序设置获取活体图像的频率。
- 选择一个新的视野并开始采集图像。为检测活性氧（ROS）水平的变化，用 100–200 μM 的 H2O2 处理细胞。与基础水平相比，这将表现为 DCF 荧光强度的增加。
6. 数据分析
- 使用 LSM 程序中的感兴趣区域（文本覆盖：ROI）工具选择区域，然后测量 TMRM 或 ROS 的荧光强度。分别选择成像细胞中线粒体区域的 ROI 或整个细胞体的 ROI，以测量 TMRM 或 ROS 的荧光强度。
- 计算每个时间点每细胞所有 ROI 的平均荧光强度（TMRM）或所有成像细胞全细胞体的 ROS 荧光强度。选择细胞邻近区域以测定背景荧光强度，进行多次测量并计算平均背景强度。
- 使用 Microsoft Excel，从每个时间点每个细胞 ROI 的平均荧光强度中减去平均背景荧光强度。减去背景强度后，使用以下公式将 TMRM 或 DCF 荧光强度归一化至基线荧光（文本叠加：ΔF = F-F₀）。o/o x 100，其中 F 为任意时间点的荧光强度，Fo 为基线荧光强度）。然后使用 Sigma Plot 程序绘制随时间变化的荧光强度变化曲线图。
7. 典型结果
图1A显示了与TMRM共同孵育的大鼠皮层神经元的荧光图像。加入线粒体解偶联剂FCCP后，导致线粒体去极化，并引起TMRM荧光强度下降（图1B）。在加入FCCP之前，TMRM荧光基础水平保持稳定（前350秒；图1C）。对TMRM荧光随时间变化的定量分析显示，加入FCCP后TMRM荧光显著降低（图1C）。
图1D显示了负载DCF的大鼠皮层神经元的荧光图像。加入H2O2后，细胞体内的DCF荧光强度增加（图1E）。在施加H2O2之前，DCF荧光的基线水平保持不变（前120秒）。DCF荧光的时间推移测量显示其水平稳定，并在H2O2处理后升高（图1F）。
图1. 活体大鼠皮层神经元中线粒体膜电位和活性氧（ROS）水平的评估。（A）加载TMRM的皮层神经元的代表性荧光图像。在扫描基础TMRM荧光后，神经元用质子载体FCCP（1 μM）处理。右侧为TMRM荧光的伪彩色强度条，亮黄色和黑色分别代表最高和最低强度。线粒体区域TMRM荧光的消失表明FCCP处理后ΔΨm的崩溃（B图）。C图显示FCCP处理前后不同时间点TMRM荧光强度变化的定量表示。（D）加载H2DCF-DA的大鼠皮层神经元的荧光图像。在确定基础DCF荧光后，细胞用200 μM H2O2处理，并检测DCF荧光的变化。DCF荧光的增强反映了H2O2处理后ROS水平的升高（E图）。F图显示H2O2处理前后DCF荧光变化的定量分析。比例尺 = 10 μm
视频.7.1 – labmedia 2704_Joshi.avi
使用40倍物镜对皮层神经元在添加FCCP前后进行TMRM的活细胞成像。伪彩色强度显示，在添加FCCP前TMRM荧光强度最高（亮黄色），添加FCCP后荧光强度降低（红色）。点击此处查看视频
视频。7.5 - labmedia 2704_Joshi.avi
皮质神经元中DCF的活细胞成像：H处理前与处理后2O2 使用40倍物镜观察。基础状态下，细胞体内的DCF荧光呈浅绿色，加入H2O2后，DCF荧光强度增强，变为亮绿色。 点击此处观看视频
讨论
我们介绍了一种逐步操作流程，用于描述如何分别使用荧光探针TMRM和H2DCF-DA测定大鼠皮层神经元的线粒体膜电位（ΔΨm）和活性氧（ROS）。对于其他类型的细胞，需通过实验经验确定TMRM或H2DCF-DA的最终浓度和负载时间。通常情况下，TMRM的浓度范围为20–200 nM，细胞与TMRM孵育的时间为20至60分钟。H2DCF-DA的最终浓度范围为2–10 μM，细胞在含有该探针的负载溶液中孵育的时间为30至45分钟。
优化成像时的激光功率和扫描速度非常重要，以避免对细胞产生光毒性，以及在无任何刺激的情况下荧光强度发生变化（例如TMRM荧光的闪烁）。在无刺激条件下，优化后的光学设置应使荧光信号既不过度饱和也不低于阈值。在特定激光功率和扫描速度下，对选定视野进行活细胞成像时，若在10-15分钟内探针的荧光强度在无任何刺激的情况下保持稳定，即表明已达到最佳成像条件。
其他用于测定线粒体膜电位（ΔΨm）的荧光探针包括罗丹明123和四甲基罗丹明乙酯（TMRE）。然而，研究发现这些探针会抑制分离线粒体的呼吸过程2。重要的是，TMRM在低浓度下对线粒体呼吸无影响2，且与其他探针相比具有较低的光毒性和光漂白性3。H2DCF-DA是一种良好的活性氧（ROS）指示剂，因其在细胞内保留良好，并可识别多种氧化性物质，如过氧化物、超氧阴离子和一氧化氮4。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院资助（J.C.B.，项目编号K22NS050137）。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 玻璃底培养皿 | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C | |
| NbActive4 | BrainBits | NbActive4 | |
| TMRM | Invitrogen | T668 | |
| H2DCF-DA | Invitrogen | C400 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| CaCl2∙2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| MgCl2∙6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| D-葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G6152 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630 |
参考文献
- Hilgenberg, L. G., Smith, M. A. Preparation of dissociated mouse cortical neuron cultures. J. Vis. Exp. , (2007).
- Scaduto, R. C. Jr, Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophys. J. 76, 469-477 (1999).
- Ward, M. W. The amyloid precursor protein intracellular domain (AICD) disrupts actin dynamics and mitochondrial bioenergetics. J. Neurochem. 113, 275-284 (2010).
- Gunasekar, P. G., Kanthasamy, A. G., Borowitz, J. L., Isom, G. E. NMDA receptor activation produces concurrent generation of nitric oxide and reactive oxygen species: implication for cell death. J. Neurochem. 65, 2016-2021 (1995).
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