一种简单的悬滴细胞培养法用于生成三维球状体

摘要

我们介绍一种简单、快速地生成类三维组织球体的方法，及其在量化细胞间相互作用差异方面的潜在应用。

摘要

对细胞间黏附和细胞-基质黏附的研究传统上是在贴附于刚性基质的单层培养物上进行的。然而，组织内的细胞通常被包裹在紧密堆积的组织团块中，细胞与多个邻近细胞以及细胞外基质组分建立紧密连接。因此，三维组织内细胞所处的化学环境和所受的物理力，与单层培养细胞所经历的条件有本质区别。这已被证明会显著影响细胞的形态和信号传导。已有多种方法被开发用于构建三维细胞培养体系，包括将细胞包埋于胶原凝胶¹或生物材料支架²中。这些方法虽然有用，但并不能重现正常组织中所见的紧密直接的细胞-细胞黏附结构，而更接近于单个细胞松散分布于细胞外基质产物构成的三维网状结构中的培养系统。本文中，我们描述一种简便的方法：将细胞置于悬滴培养体系中，在生理条件下孵育，直至其形成真正的三维球状体，其中细胞彼此直接接触，并与细胞外基质组分接触。该方法无需特殊设备，且可灵活调整，适用于加入极微量的任何生物学试剂，以研究其对细胞-细胞或细胞-细胞外基质相互作用的影响。该方法也可用于共培养两种（或多种）不同细胞群体，以阐明细胞-细胞或细胞-细胞外基质相互作用在决定细胞间空间关系中的作用。细胞-细胞黏附和细胞-细胞外基质黏附是研究胚胎发育、恶性侵袭中肿瘤-间质细胞相互作用、伤口愈合以及组织工程应用的基础。这一简便方法将为生成类组织的细胞聚集体提供手段，用于在生理相关模型中进行生物力学性质测定，或分子与生化分析。

方案

1. 单细胞悬液的制备

1. 贴壁细胞培养至90%融合度时，应用PBS冲洗单层细胞两次。充分吸干后，加入2 ml（100 mm培养皿）0.05%胰蛋白酶-1 mM EDTA，于37°C孵育至细胞脱落。加入2 ml完全培养基终止消化反应，并用5 ml移液管轻轻吹打混悬液，直至细胞完全悬浮。将细胞转移至15 ml锥形离心管中。
2. 加入40 μl 10 mg/ml的DNA酶储备液，室温孵育5分钟。短暂涡旋振荡后，以200 ×g离心5分钟。
3. 弃去上清液，用1 ml完全组织培养基洗涤沉淀。重复一次，然后将细胞重悬于2 ml完全组织培养基中。
4. 使用血细胞计数板或自动细胞计数仪对细胞进行计数，并将浓度调整至2.5 × 10⁶ 个细胞/ml。本演示中使用了BioRad TC10自动细胞计数仪。

2. 悬滴的形成。

1. 取一个60 mm的组织培养皿，移除皿盖，并在培养皿底部加入5 ml PBS，作为保湿室使用。
2. 将皿盖翻转，在其底部使用20 μl移液器滴加10 μl液滴，确保液滴之间保持足够间距，避免相互接触。每个培养皿中至少可放置20个液滴。
3. 将翻转后的皿盖盖在含有PBS的底部培养皿上，置于37°C、5% CO₂、95%湿度条件下孵育，每日观察液滴情况，持续孵育直至细胞片层或细胞聚集体形成。可使用体视显微镜评估聚集体的形成情况。
4. 一旦形成细胞片层，可将其转移至含有3 ml完全培养基的圆底玻璃摇瓶中，并在37°C、5% CO₂条件下置于摇动水浴中孵育，直至类球体形成。

3. 注意事项

1. 根据细胞大小，可能需要向上或向下调整浓度。
2. 可在悬滴形成前，使用膜嵌入型荧光染料对细胞进行染色。
3. 两种不同类型的细胞可在形成悬滴前用不同荧光染料分别标记，并按1:1（或其他比例）混合。这些细胞可以是癌细胞和间质细胞、胚胎组织，或经基因工程改造具有特定黏附特征的细胞。
4. 可使用含2 mM钙的0.05%胰蛋白酶消化细胞，从组织培养皿上分离细胞，以保持钙黏蛋白功能。
5. 根据实验需求，可测量片状结构的尺寸，或利用细胞聚集体进行力学测试，或进行生物化学及分子分析。

4. 代表性结果：

单层或球状体的形成通常在24小时内发生，但具体时间可能因细胞类型而异。图1显示了未经处理的前列腺癌MAT-LyLu（MLL）细胞在悬滴培养中孵育18小时后（图1A）以及经25 μm MEK抑制剂PD98059处理后的细胞所拍摄的图像。请注意，MEK抑制剂（MEKi）处理会导致细胞单层明显收缩。收缩程度可通过测量10–20个（或更多）悬滴的大小，并比较不同处理组之间的平均尺寸进行量化。我们通常使用ImageJ软件分析图像：首先对每幅图像进行阈值设定，然后将图像转换为二值模式，接着进行颗粒分析，以获得以像素为单位的图像总面积，随后可轻松换算为平方微米。图2展示了未经处理与MEKi处理的MLL细胞的尺寸比较。如图所示，通过Student's t检验比较，MEKi处理显著减小了细胞单层的尺寸（P<0.0001）。在该比较中，分别测量了未经处理组和处理组各10个细胞聚集体。图3显示了一个鸡胚肝脏球状体，在悬滴培养中培养24小时后，再于摇床中培养2天形成。

悬挂液滴实验也可进行改良，以包含多种细胞类型，从而揭示其采用的空间定位。例如，可分离鸡胚胎肝脏细胞，用荧光膜嵌入染料进行染色，并与用不同荧光标记物染色的鸡胚胎心肌细胞混合。图4A显示，肝脏细胞与心肌细胞并非保持混合状态，而是倾向于彼此“分离”，形成一种肝脏细胞包裹心肌细胞的同心球状结构。这种结构可通过肝脏细胞与心肌细胞之间细胞间黏附性的差异加以解释。这一概念被归纳为差异黏附假说（Differential Adhesion Hypothesis），该假说已被用于解释两栖类³和硬骨鱼类⁴胚胎中胚层组织之间的细胞分选行为、胰岛细胞的组织结构⁵，以及两种在其他所有方面均相同、仅在钙黏蛋白（cadherin）表达水平上存在差异的细胞群体之间的细胞分选现象（⁶及图4B）。该结果对于阐明如何通过调控细胞群体间简单的黏附性差异来构建器官结构（例如胰岛⁵）具有重要意义。

图1. 细胞在悬滴培养中孵育18小时后的图像，分别在无（A）或含有25 μm MEK抑制剂PD98059（B）的条件下培养。图像使用Nikon Eclipse TE 300落射荧光显微镜和Photometrics CoolSnap ES数字相机拍摄。

图2. MEK抑制剂诱导大鼠前列腺癌MLL细胞聚集体压缩的定量分析。将未处理和经MEKi处理的MLL细胞进行悬滴培养，孵育18小时后，按照上述方法测定聚集体大小。聚集体大小的统计学分析采用Student t检验。星号表示未处理组与MEKi处理组之间聚集体大小具有统计学显著性差异（P<0.0001），提示MEKi处理可导致聚集体显著变小且更为致密。

图3. 将鸡胚胎肝细胞在悬滴培养中孵育18小时，随后在培养箱/摇床中培养48小时后形成的球状体。该图像使用尼康SMZ800体视显微镜和索尼Black CCD相机拍摄。

图4. 悬滴培养揭示了不同类型细胞之间的分选行为。在图A中，鸡胚胎肝细胞用PKH-2膜嵌入染料标记，并与用PKH-26标记的鸡胚胎心细胞等比例混合。在图B中，两个转染了N-钙黏蛋白（N-cadherin）的L细胞克隆（LN4和LN2a），其表面N-cad表达比例为2.4:1，也分别用荧光膜嵌入染料PKH-2和PKH-26（Sigma-Aldrich）标记后等比例混合，并以悬滴法进行培养⁷。培养18小时后，将细胞团转移至摇瓶中，再继续孵育48小时。随后用含2%多聚甲醛的磷酸盐缓冲液固定聚集体，并使用连接于Nikon Optiphot-2显微镜的BioRad MRC600扫描激光共聚焦显微镜系统进行观察。采集绿色和红色两个通道的光学切片图像，并在配备Vital Images Voxel View Ultra成像软件的Silicon Graphix Crimson VGX工作站上对两个通道分别赋予伪彩色并合并图像，以显示所形成的解剖结构。（A）穿过聚集体的共聚焦光学切片，显示肝细胞（伪彩色为蓝色）包裹心细胞（伪彩色为黄色）（引自⁸）。（B）穿过聚集体的共聚焦光学切片，显示高表达N-钙黏蛋白的细胞（绿色）被低表达N-钙黏蛋白的细胞（红色）所包裹（引自⁶）。

讨论

研究表明，与刚性的二维（2D）培养系统相比，在三维（3D）环境中培养细胞会产生不同的细胞形态和信号传导⁹例如，成纤维细胞接种的胶原凝胶表明，成纤维细胞在三维环境中的形态与在二维条件下观察到的形态显著不同 ^10,11类似地，三维培养可诱导乳腺上皮细胞产生组织特异性的分化。三维培养系统已被用于区分正常细胞与恶性细胞，并且在适当刺激条件下，已被证明能够支持转化细胞逆转为正常表型。^12,13正确的组织结构对于远端稳态的维持、凋亡的抑制以及CID-9乳腺上皮细胞分化表型的保持也至关重要。 ¹⁴多细胞耐药性在小鼠EMT-6乳腺癌细胞中也已被证实存在 体外 仅当细胞在三维构型中培养，而非在传统的单层培养中时¹⁵这些及其他数据促使人们提出这样的观点：“在高等生物中，功能的基本单位既不是基因组，也不是单个细胞，而是组织本身”。 ¹⁶. 生成三维球状体的其他方法还有很多，包括使用模拟微重力培养箱 ¹⁷，以及微模压非粘附性水凝胶 ^18,19然而，与这些方法不同，本文所...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
自动细胞计数仪	Bio-Rad	TC10
带 CO2 气体盖的摇床水浴箱	Labline Instruments	3540