用于创伤性脑损伤研究的神经元细胞冲击性加压

摘要

已开发出一种使用霍普金森杆装置的新型脉冲式细胞加压实验，用于研究爆炸所致创伤性脑损伤的分子/细胞机制。

摘要

本研究利用Kolsky杆装置开发了一种新型的脉冲式细胞加压实验方法，用于研究爆炸引起的创伤性脑损伤（TBI）。在本视频文章中，我们展示了如何在体外对神经元细胞施加与爆炸性TBI相关的脉冲式加压。该方法通过特制的Kolsky杆装置产生高度可控的压力脉冲，并完整记录细胞加压腔内的压力变化历程。加压后的神经元细胞可在加压后立即进行检测，或继续培养以评估脉冲加压对神经突/轴突发育、神经元基因表达、细胞凋亡等长期影响。我们观察到，在约2 MPa的脉冲加压下，神经突的损失明显多于未加压的细胞。本技术提供了一种新颖的方法，可通过在精确控制的压力强度和持续时间下对脑细胞进行脉冲加压，来研究爆炸性TBI的分子/细胞机制。

方案

1. 神经元细胞培养

1. 可使用包括神经元细胞、星形胶质细胞及其共培养体系在内的脑细胞作为细胞模型。作为可行性验证，本文展示了对细胞系来源的神经元细胞进行脉冲式加压处理。
2. 将SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞（ATCC, CRL-2266）培养于直径为18 mm的玻璃盖玻片上。使用含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基，以3×10³ cells/cm²的密度接种细胞。细胞培养用载玻片置于37°C、5% CO₂的湿化培养箱中孵育。
3. 为诱导SH-SY5Y细胞向神经元细胞分化，加入含10 μM视黄酸（RA）的培养基继续培养7天，每两天更换一次培养基。第7天时，细胞即可用于加压处理。

2. 加压设备：霍普金森杆

1. 由 Kolsky¹ 于 1949 年开发的 Kolsky 杆装置已被用于测量材料在极高加载速率下的力学性能。该装置由两根杆组成，样品置于两杆之间并与其接触。在入射杆上产生应力波，该应力波传播至样品处并分裂为反射波和透射波。样品中的应力与透射波成正比。在本研究中，我们利用一个细胞加压室，将其置于 Kolsky 装置的两根杆之间。
2. 两根铝合金杆（每根长 6 米）通过排列对齐的黄铜轴承悬挂，体外细胞加压室被夹在两杆之间。上游杆为入射杆，其一端固定一个 130 磅重的质量块。摩擦夹具安装在可提供所需脉冲持续时间的位置。通过启动夹具，并在质量块与加载支撑之间拧紧剪式千斤顶，使入射杆的夹具-质量块部分被预压缩至所需水平。利用液压系统迫使一个带缺口的螺栓突然断裂，从而迅速释放预存储的压缩能量，产生压力脉冲。该脉冲通过入射杆传播，驱动测试室活塞，进而对腔室内的流体和细胞进行瞬时加压。腔室的加压反过来在下游的透射杆中引发一个压力脉冲。杆中压力脉冲相关的应变通过激发至 45 伏的复合高阻应变片进行测量。应变片信号以 1 MHz 频率由数字示波器记录，形成加载历史。
3. 体外细胞加压室由活塞-气缸结构组成。气缸内径为 2.6 cm，外径为 3.8 cm，腔体底部加工有一个小孔。该孔在细胞样品安装过程中用于排出空气和多余液体。活塞长 7.5 cm，由与杆相同的材料制成。活塞表面缠绕两到三层 plumber's（聚四氟乙烯）胶带，作为低摩擦密封层。端盖长 32 mm，配有两颗小型不锈钢螺钉，用于在加载过程中固定载有细胞的玻璃盖玻片。

3. 神经元细胞的脉冲加压

1. 所有加压室部件均通过高压灭菌器进行灭菌，并置于紫外线下保存。加压室的组装在细胞培养罩内进行。将排气螺钉松散地旋入腔体底部的通气孔中。用移液器将预热（37°C）的新鲜培养基加入加压室，避免产生气泡。然后取出已培养细胞的玻片，将其放置在活塞盖上（细胞面朝外）。拧紧小型固定螺钉以固定玻片。将带有细胞培养玻片的活塞略微插入加压室腔体内，并倾斜整个组件，使通气口位于最高点。取下排气螺钉，推动活塞进入腔体，首先排出空气气泡，然后挤出多余液体。每次实验均使用参考标记或定位夹具作为引导，以确保培养基体积一致。加压室内培养基的轴向尺寸约为6 mm。对排气螺钉进行消毒后重新安装，确保加压室密封不漏水。在静态负载下加压室不应发生泄漏，若出现泄漏，则需更换或加固聚四氟乙烯密封带。
2. 此时，Kolsky杆系统复位。将重物移回原始位置，并用新的锁定螺栓替换已使用（断裂）的螺栓。通过液压装置将新锁定螺栓加压至约200 psi。使用剪式千斤顶压缩入射杆预加载段，压力略高于目标值，随后略微回松，以充分激活千斤顶螺杆的摩擦力。数据采集系统现已准备就绪。
3. 将组装好的细胞加压室安装至系统中。将其置于由小型实验室剪式千斤顶支撑的V型块上，并与两根杆件对齐。在各接触界面涂抹薄层润滑脂，并相互摩擦对接表面，以消除其间任何空气间隙。
4. 实验现已准备就绪。通过快速泵动液压夹具驱动器使夹具锁定螺栓断裂。夹具分离后，数据采集系统应显示测试结果。细胞所受压力历程由透射杆应变测量确定。若所用透射杆足够长，则有效信号应仅从首次扰动开始，至测量值显示负压为止。若存在气泡，透射脉冲持续时间可能短于入射脉冲。压力幅值可能未达到入射脉冲水平，但应在卸载前保持足够长的平台期。否则，可能是密封腔室内存在较大气泡，或组件与杆件之间存在对准偏差所致。
5. 随后将细胞加压室从系统中取出，并在细胞培养罩内拆解。取下排气螺钉，将活塞从加压室中抽出。从活塞末端取下带有细胞的玻片。

4. 评估加压细胞行为

1. 加压后，可立即检查细胞，或进一步孵育以供后续观察。若操作过程保持无菌，可实现较长时间的孵育后培养。
2. 加压处理的细胞可采用所有分子生物学和细胞生物学技术进行检测。针对神经元细胞加压实验，为研究创伤性脑损伤（TBI）条件下的细胞与分子生理变化，可开展评估加压诱导的神经突起生长变化、微管细胞骨架改变、神经元基因表达变化、细胞凋亡等的检测。作为对照细胞样本，使用相同条件下培养、在加压 chamber 中放置相同时间但未进行加压处理的细胞（即所谓的 chamber 对照）。
3. 为评估神经突起生长的变化，需在加压后立即以及加压后1小时和24小时，通过光学显微镜检查加压细胞和 chamber 对照细胞。神经元细胞图像示例见“代表性结果”部分（图2）。神经突长度的变化可通过肌动蛋白免疫荧光染色结合图像分析进行定量。具体步骤为：使用4%（w/v）多聚甲醛溶液固定细胞，用0.05%（v/v）Tween-20洗涤缓冲液冲洗，并用0.1%（v/v）Triton X-100溶液进行透化处理。用1%（w/v）牛血清白蛋白溶液封闭后，将细胞与四甲基罗丹明异硫氰酸酯（TRITC）标记的鬼笔环肽孵育。使用荧光显微镜采集细胞的免疫荧光图像，并利用ImageJ软件（NIH）对加压组与对照组细胞的神经突长度进行定量分析。
4. 神经突可被鉴定为轴突或树突。为评估轴突或树突的形态学变化，可重复上述实验，使用特异性识别各结构的抗体，即采用神经丝蛋白（NF）抗体标记轴突，微管相关蛋白（MAP2）抗体标记树突。
5. 微管是神经元细胞骨架的关键组分之一，微管损伤已被用作神经元损伤的标志物²。可通过β-微管蛋白抗体进行免疫荧光染色以可视化微管结构。在加压后0小时和24小时分别固定细胞，使用β-微管蛋白抗体染色后，通过荧光显微镜观察。
6. 为评估脉冲式加压对神经元及凋亡相关基因表达的影响，从加压处理组和对照组细胞中提取总RNA。基因表达水平可通过定量RT-PCR或实时RT-PCR进行检测，方法参照我们已发表的实验方案³。

5. 代表性结果：

图 1. 施加于加压室内细胞的压力波形示例。Kolsky 杆装置成功产生了约 0.7 ms 持续时间、2 MPa 水平的单脉冲型冲击加压。

图2. 神经元细胞对脉冲式加压反应的一个示例。暴露于2 MPa脉冲式加压条件下的SH-SY5Y细胞，相较于培养腔室对照组细胞，表现出明显的神经突/轴突断裂。

6. 困难与解决方案

1. 腔室密封是需要克服的主要障碍之一。研究发现，带有O型圈的宽圆盘存在刻痕和摩擦增加的问题。为了消除摩擦效应并防止刻痕，采用了一种简单的方法，即使用聚四氟乙烯（特氟龙）生料带对活塞进行缠绕。该方法解决了上述问题，并实现了所需的压强水平和持续时间。
2. 在评估继发性创伤性脑损伤机制或长期效应时，应于长时间孵育后观察加压条件下神经元细胞的行为。在将含细胞的腔室转移至霍普金森压杆装置、加压后再返回细胞培养超净台的过程中，腔室可能暴露于非无菌环境中。通过对腔室部件进行预先灭菌，并在细胞培养超净台内规范地组装和拆卸细胞培养载片与腔室，可实现长达数周的长期孵育后观察。
3. 数据的可重复性是细胞力学刺激实验中的一个重要参数。对于本装置而言，神经元细胞反应的可重复性取决于目标脉冲式加压曲线（包括压强水平和持续时间）能否被重复获得。由于每次加压过程中的实际压力曲线均被记录，因此后续可手动剔除因非预期压力曲线所获得的细胞反应数据。
4. 整个加压操作流程，包括腔室组装、转移并安装到霍普金森压杆装置、加压、返回转移以及腔室拆卸，耗时少于10分钟。前一次加压完成后可立即对下一张细胞培养载片进行加压，从而高效完成足够数量的加压实验。本实验系统使用直径为18 mm的玻璃盖玻片。单次加压实验因基底面积有限（部分加压细胞死亡也是原因之一）所获得的蛋白量不足以用于蛋白质免疫印迹分析。大约需进行三次重复加压实验才能获得足够的蛋白量用于免疫印迹检测。每次实验均需通过压力曲线验证其可重复性。

讨论

已有多种体外实验技术被用于研究创伤性脑损伤（TBI）条件下的脑细胞损伤，包括神经元/星形胶质细胞拉伸、流体诱导剪切应力、落锤冲击、探针划伤、激光切断、冲击波碎石等^4,5。人们普遍认为，短时间的超压是导致TBI的主要物理因素^6,7。特别是爆炸性TBI中的冲击波，其脉冲持续时间在毫秒量级⁴。基于这一假设和观察，研究人员开发并使用了能够实现瞬态加压的测压室装置，以评估TBI条件下脑细胞的行为。例如，在液体冲击测压创伤室中，曾采用持续时间为20–30 ms、峰值压力高达0.5 MPa的压力脉冲来研究人源胶质细胞在TBI条件下的反应⁶。最近，VandeVord等人⁷使用金属球撞击测压室来研究星形胶质细胞在TBI下的行为，但金属球撞击会产生多个压力脉冲。在本研究中，我们开发了一种新型细胞加压装置，可产生单脉冲型冲击性超压。该装置基于Kolsky杆系统构建，后者已在我们⁸及其他研究者的工作中^1,9被用作材料测试设备。我们对Kolsky杆在极高加载速率下的材料测试能力进行了改造，使其能够在加压室内对培养细胞施加单脉冲型超压（图1）。我们能够成功调控冲击性超压的强度和持续时间。作为代表性细胞反应，我们证明了在2 MPa压力下，SH-SY5Y神经元细胞相较于未加压对照组细胞表现出显著的神经突和轴突丢失。

综上所述，我们利用专门设计的Kolsky杆装置开发了一种新型的脉冲式细胞加压设备，并展示了其在研究创伤性脑损伤（TBI）条件下神经元细胞反应中的潜在应用价值。我们还注意到，该技术具有高度的通用性，可对任意类型的细胞施加不同强度和持续时间的脉冲压力。因此，该装置不仅可用于研究脉冲压力诱导的细胞损伤，还可用于探究脉冲压力对细胞功能和命运决定的正向刺激作用，即细胞力传导行为的研究。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
SH-SY5Y（ATCC，CRL-2266）人神经母细胞瘤细胞
直径18 mm的玻璃盖玻片
细胞培养基：DMEM，10% 胎牛血清，1% 青霉素-链霉素
用于诱导神经发生的视黄酸（10 μM）
Kolsky杆脉冲加压装置
活塞-圆筒细胞加压腔
用于将培养细胞的盖玻片固定在活塞上的不锈钢螺丝
用于细胞腔与Kolsky杆接口之间的密封油脂
用于评估细胞对加压反应的常规分子生物学试剂（固定剂、抗体、荧光染料、PCR试剂等）