癫痫持续状态后大鼠心脏风险指标及对乌头碱诱发心律失常易感性的ECG评估方法

摘要

本文描述了通过心电图（ECG）记录大鼠癫痫持续状态（SE）后心脏电活动的测量技术，以及对心脏风险因素和心律失常易感性的分析方法。

摘要

致死性心律失常是多种病理状态下导致死亡的重要原因。通过无创、易于获取的心电图（ECG）获得的多个参数，已被确立为心肌病患者心脏风险的可靠且经过充分验证的预后指标。心率增快、心率变异性（HRV）降低，以及心室电活动持续时间及其变异性增加（QT间期延长）均提示心脏风险升高^1-4。在动物模型中，比较这些由心电图导出的变量与实验性诱发心律失常的易感性具有重要价值。静脉输注致心律失常药物乌头碱已被广泛用于评估多种实验条件下心律失常的易感性，包括抑郁症⁵和高血压⁶的动物模型、运动后状态⁷以及暴露于空气污染物后的情况⁸，同时也用于评价药理学药物抗心律失常效果的有效性^9,10。

需要注意的是，人类中的QT离散度是通过标准12导联心电图所有导联的QT间期变异程度来衡量的。因此，本实验方案中描述的大鼠2导联心电图所测得的QT离散度，与从人类心电图记录中计算出的QT离散度有所不同。这表明从啮齿类动物获得的数据向人类临床医学转化时存在一定的局限性。

癫痫持续状态（SE）是指单次发作或一系列连续反复发作的癫痫，持续时间超过30分钟^{11,12 11,12}，其病死率可达20%¹³。许多患者虽能度过癫痫持续状态，但在30天内死亡^14,15。这种延迟性死亡的机制尚未完全阐明。有研究提示，致死性室性心律失常可能是导致这些死亡的重要原因之一^14-17。除了癫痫持续状态外，出现自发性反复癫痫发作的患者（即癫痫患者）也面临癫痫相关性早发性猝死（SUDEP）的风险¹⁸。与癫痫持续状态类似，SUDEP的确切发生机制尚不清楚。已有研究提出，心室异常及其引发的心律失常可能在其中起着重要作用^18-22。

为了研究癫痫相关性心脏死亡的机制以及心脏保护治疗的有效性，有必要在癫痫动物模型中获取由心电图衍生的风险指标，并评估其对心律失常的易感性^23-25。本文描述了在匹罗卡品诱导的癫痫持续状态（SE）后，于Sprague-Dawley实验大鼠（Rattus norvegicus）体内植入心电图电极的方法，以及心电图记录的采集与分析，并通过静脉输注乌头碱诱导心律失常。

这些方法可用于直接确定从心电图获得的心脏电活动指标与癫痫发作障碍大鼠模型或其他与猝死风险增加相关的病理状态下心室心律失常易感性之间的关系。

方案

1. 构建所需材料

1. 颈静脉导管由一段 PE-50 聚乙烯管（100 mm）制成，一端斜面处理，然后充满肝素盐水（50 U 肝素/mL 盐水）。
2. 心电图记录电极由两根 100 mm 长的绝缘银线（30AWG）制成。两根导线的一端去绝缘层后焊接到微型连接器上，绝缘层绞合形成第三根用作接地的导线。导线远端去除 5 mm 绝缘层并丢弃。

2. 植入颈静脉导管

1. 通过腹腔注射乌拉坦（1.2 g/kg）对动物进行麻醉。
2. 定期（每10分钟）检查麻醉深度，通过评估足底回缩反应和/或眼反射来判断；必要时追加麻醉剂。
3. 当动物达到适当的麻醉平面后，剃除颈部右侧从锁骨至下颌区域的毛发。
4. 在颈动脉上方的皮肤做一纵向切口（10–15 mm），并撑开切口。
5. 采用钝性分离技术，分开下方肌肉组织，以定位并分离右侧颈外静脉。
6. 将两根外科丝线（#2）置于颈外静脉下方，分别位于切口的头端和尾端；结扎头端结扎线，以阻断静脉血流。
7. 牵拉尾端结扎线，将血管从下方组织抬起后做一小切口，插入内含肝素（50 U/ml 生理盐水）的PE-50聚乙烯导管（斜面端朝前，长度100 mm），并将导管尖端向前推进约8 mm，到达右心房水平。
8. 为固定导管，将尾端结扎线围绕血管和导管一并结扎；最后使用伤口夹或缝线关闭切口。
9. 在导管植入过程中，暴露的导管末端应使用止血钳夹闭或堵塞，以防止在连接输液泵前发生血液逆流。

3. 植入CG电极

1. 将动物仰卧放置并剃除胸部毛发。
2. 电极放置时，做两个纵向切口（≈ 10 mm），分别位于胸部的右上象限和左下象限，并游离其上方的皮肤以暴露胸肌。
3. 将银丝电极暴露的5毫米端之一缝合至每个暴露区域的胸肌内，并将接地电极置于皮下。
4. 用伤口夹闭合切口，并将微连接器插入记录设备。
5. 用毛巾松松地包裹动物，以在操作过程中维持其体温。

4. 记录心电图

1. 使用 Powerlab 数据采集系统和 Macintosh 计算机或类似硬件/软件进行记录（放大倍数 50 倍；滤波范围 1-1000 Hz）。
2. 经过 20-30 分钟的平衡期后，记录 20 分钟心电图（ECG）。

5. 诱发心室性心律失常

1. 将颈静脉导管连接至置于可编程输液泵中的远程注射器。
2. 以恒定速率开始乌头碱输注，剂量为 5 µg/kg/min，持续 7 分钟。
3. 出现心室颤动或输注结束后，采用批准的程序对动物实施安乐死。

6. 心电图分析

1. QT 间期代表心室电活动的总持续时间。图 1 显示了模型心电图记录及 QT 间期的持续时间。计算在 20 分钟记录期间内、连续五分钟时间段中所有记录心跳的 Q 波起始至 T 波终止之间的平均时间。
2. 为校正心率对 QT 间期的影响（QTc），采用 Bazett 公式：QTc = QT / (RR)^½，其中 RR 为心跳间期的平均值。RR 间期的计算依据为分析期间连续 Q 波之间的持续时间。
3. QT 离散度（QTd）通过计算每只动物记录中最大 QT 间期与最小 QT 间期之差得出。

7. 心率变异性分析

1. 用于自动计算心率时域和/或频域变异性的软件程序（例如 LabChart 7，ADInstruments 公司）可分析在分析期间获得的 RR 间期变异性。

8. 心室性心律失常易感性的分析

1. 计算从开始输注乌头碱到首次出现室性期前收缩（PVC，图2，面板1）、室性心动过速（VT，图2，面板2）和心室颤动（VF，图2，面板3）的潜伏期。

9. 代表性结果

图3展示了对照组大鼠以及在测试前一周经历癫痫持续状态（SE）的大鼠在频域内心率变异性（HRV）的一项指标（RR间期标准差的均方根，RMSSD）。该HRV指标反映副交感神经对心脏功能调控的变化²⁶，在癫痫持续状态后显著降低。图4显示，在癫痫持续状态发生两周后，校正QT间期（QTc，图A）和QT离散度（QTd，图B）均显著增加²⁷。综合来看，这些数据表明癫痫持续状态会增加室性心律失常的风险。这一预测得到了以下发现的支持：在本研究中，诱发实验性心律失常（包括室性早搏PVC、室性心动过速VT和心室颤动VF）所需的乌头碱输注时间在癫痫持续状态后的大鼠中显著缩短（图5）²⁷。

图1. 正常心跳的模型心电图记录，显示P波、QRS波群和T波。QT间期为两条虚线之间的时间间隔。

图2. 图1） 室性早搏（PVCs）是指在正常心搏（A）之间出现的独立的心室收缩（B），其心电图特征为缺乏P波和T波。 图2 室性心动过速（VT）是指一系列连续发生的多个心室收缩（C），其间无正常的正常心搏（A）。 图3 心室颤动（VF）表现为无明确节律，且QRS波与P波之间无任何关联（D）。

图3. 对照组大鼠与在测试前1周经历癫痫持续状态（SE）的大鼠心搏间期标准差的均方根（RMSSD；毫秒）。**p<0.01，与对照组比较。

图4. 从对照组动物（Cont）和在测试前两周经历癫痫持续状态（SE）的大鼠获得的心电图记录中计算出的平均校正QT间期（A部分）和QT离散度（B部分）。*p<0.05，与对照组比较。（Metcalf 等，Am. J. Physiol. Heart and Circ, 2009, Am Physiol Soc，经²⁷许可使用）。

图5. 对照组动物（Cont）与测试前两周经历癫痫持续状态（SE）的大鼠在乌头毒素输注开始至首次室性期前收缩（PVC）、室性心动过速（VT）及心室颤动（VF）发生之间的时间潜伏期（秒）。*p<0.05，**p<0.01，与对照组相比。（Metcalf 等，Am. J. Physiol. Heart and Circ, 2009, Am Physiol Soc，经²⁷许可使用）。

讨论

所述操作中有两个方面至关重要。首先，乌头碱向心脏的给药速率必须在各动物之间保持一致。这要求颈静脉导管尖端相对于心脏的位置保持一致，并仔细调节输注速率。为了能够适当地评估心室心律失常发生时间与易感性改变之间的关系，乌头碱递送至心脏的速率必须相等。如果乌头碱递送速率存在差异，则心律失常的潜伏期差异可能源于药物浓度的不同，而非心脏功能的改变。其次，心电图记录电极的制备与放置必须获得无伪迹的记录，且P波、QRS波群和T波必须清晰可辨。虽然心率、心率变异性（HRV）以及心室心律失常的发生情况可仅通过QRS波群确定，但校正QT间期（QTc）和QT离散度（QTd）的计算则必须依赖于包含清晰可辨Q波起点和T波终点的心电图记录。

这些技术的一个明显局限性在于它们是在麻醉动物中进行的。然而，这出于两个必要原因：1）由于心电图电极被植入骨骼肌组织中，在清醒的大鼠活动时会产生运动伪迹。这些非心脏信号经常掩盖心功能适当分析所必需的心电图信号。2）在清醒动物中诱发乌头碱性心律失常会引发潜在的伦理问题。

这些方法可对同一动物同时进行多种公认的SCD预后指标...