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一种用于蚊子（Aedes aegypti）和蜱虫（Rhipicephalus microplus）G蛋白偶联受体功能分析的钙离子生物发光检测法

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DOI：

10.3791/2732

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2011年4月20日

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1Department of Entomology, Texas A&M University (TAMU), 2Department of Molecular and Cellular Medicine, Texas A&M University (TAMU)

本文内容

摘要

本实验方案提供了克隆细胞系筛选及钙依赖性生物发光检测的方法，用于分析合成节肢动物神经肽与其同源G蛋白偶联受体之间的构效关系。该检测方法可用于受体去孤儿化研究，以及合成类似物设计和肽类/药物先导物发现中的构效关系研究。

摘要

节肢动物激素受体是新型杀虫剂的潜在靶点，因为它们调控许多重要的生理和行为过程。其中大多数属于G蛋白偶联受体（GPCRs）超家族。我们专注于鉴定蜱虫和蚊子中的节肢动物激肽受体。节肢动物激肽是一类具有肌动、利尿和神经递质功能的多功能神经肽。本文描述了一种在两种异源表达激肽受体系统中系统分析昆虫激肽构效关系的方法。我们提供了与开发具有生物稳定性的激肽类似物相关的重要信息，这类类似物有望干扰蜱虫和蚊子的利尿、肌动和/或消化过程。

将来自南方牛蜱Boophilus microplus（Canestrini）和埃及伊蚊Aedes aegypti（Linnaeus）的激肽受体稳定表达于哺乳动物CHO-K1细胞系中。通过钙离子生物发光板式检测法对这些受体进行功能分析，该方法通过检测细胞内生物发光来确定重组细胞在施加肽类物质后胞浆中的钙离子水平。该方法利用了水母发光蛋白aequorin，这是一种从发光水母中分离得到的光蛋白。我们将aequorin质粒（mtAEQ/pcDNA1）瞬时转染至稳定表达激肽受体的细胞系中，随后用辅因子腔肠素（coelenterazine）处理这些细胞，使其与细胞内的aequorin形成复合物。当钙离子存在时，该复合物断裂并释放出与钙离子浓度相对应的发光信号。由于激肽受体通过释放细胞内钙离子进行信号传导，因此信号强度与肽类物质的活性呈正相关。

本方案综合了先前描述的多种方案并进行了修改，通过功能性板式检测法，逐步介绍了在哺乳动物细胞系中稳定表达G蛋白偶联受体（GPCRs）的操作步骤（Staubly et al., 2002 和 Stables et al., 1997）。利用该方法，我们成功建立了稳定表达蚊子和蜱类缓激肽受体的细胞系，比较了三种蚊类缓激肽的活性，鉴定了配体-受体相互作用中的关键氨基酸位点，并对一个肽库进行了半高通量筛选。由于昆虫缓激肽易被内源性肽酶快速降解，其在害虫控制或内分泌学研究中的应用受到严重限制。因此，我们还测试了含有氨基异丁酸（Aib）的缓激肽类似物，以增强其活性和生物稳定性。这种抗肽酶降解的类似物为开发具有生物稳定性的昆虫缓激肽类似物提供了重要先导化合物，并可能有助于基于神经肽的节肢动物防控策略的研发。

方案

1. 稳定细胞系的建立

  1. 克隆您感兴趣的G蛋白偶联受体（GPCR），并将其插入含有5'端Kozak共有序列（GCCA/GCCATGG）的表达载体中，以在哺乳动物系统中实现核糖体的最佳结合（Kozak, 1986）。本实验中，我们使用质粒pcDNA3.1/Bm-KR表达蜱类激肽受体，使用质粒pcDNA3.1/Aedae-KR表达蚊类激肽受体（Holmes et al., 2003; Pietrantonio et al., 2005）。pcDNA3.1(-)载体在细菌中赋予氨苄青霉素抗性，用于筛选；在哺乳动物细胞中则赋予新霉素（G418）抗性。
  2. 在T-25培养瓶（BD Falcon）中，于37°C、5% CO2的湿润培养箱中培养CHO-K1空细胞（不含质粒）（ATCC，美国弗吉尼亚州马纳萨斯）或其他所需细胞系（Holmes et al., 2003）。除非另有说明，所有后续孵育均应在上述条件下进行。使用生长培养基（F12K培养基含10%胎牛血清）并添加1×抗生素-抗真菌剂（Invitrogen，CA）维持空细胞培养。
  3. 传代细胞时，将所有溶液预热至37°C。吸除T-25培养瓶中的旧培养基，用5 ml PBS清洗后弃去PBS。进行细胞消化时，加入2 ml PBS-胰蛋白酶-EDTA溶液（34 ml PBS，2 ml 7.5%碳酸氢钠，4 ml 10×胰蛋白酶-EDTA）作用2分钟。加入3 ml培养基，反复吹打混匀细胞。将含细胞的培养基转移至离心管，以约200–300 g（1,000 rpm）离心2分钟。弃上清，用5 ml培养基重悬细胞。将细胞悬液用新鲜培养基按1:5或1:10比例稀释，取5 ml转移至新的T-25培养瓶中。
  4. 待细胞健康生长约2–3天后，将CHO-K1细胞接种至T-25组织培养瓶中，在不含抗生素的生长培养基中过夜培养，直至细胞汇合度达约30%（约18小时）。可通过倒置荧光显微镜观察细胞状态判断汇合程度。
  5. 为每个样品准备以下混合液：
    1. 将1–2 μg DNA（示例：4 μl浓度为265 μg/μl的pcDNA3.1/Aedae-KR）与100 μl Opti-MEM I低血清培养基（Invitrogen）混合。
    2. 将6 μl Lipofectin转染试剂（InvitrogenTM）加入100 μl F12K无血清培养基中，使Lipofectin与DNA体积比为1:1。室温孵育30–45分钟。
    将1.5.1与1.5.2所得溶液轻轻逐滴混合（总体积 = 200 μL），室温静置10–15分钟。
  6. 吸除细胞中的旧生长培养基，用5 ml F12K无血清培养基清洗细胞后弃去该培养基。在15 ml离心管中，将转染混合液轻轻逐滴加入1.8 ml新鲜F12K培养基中混匀。随后用PBS清洗步骤1.5中的细胞，并将新的转染溶液加入细胞中。孵育18小时。
  7. 更换为含10%胎牛血清但不含抗生素的F12K培养基，过夜孵育。将细胞按1:2比例传代至两个含相同培养基的T-25培养瓶中继续培养18小时（传代操作参见步骤1.3）。
  8. 更换为筛选培养基（F12K培养基含10%胎牛血清及800 μg/ml GENETICIN，Invitrogen）。使用该筛选培养基连续培养细胞3–4周，以筛选出稳定整合质粒至基因组DNA中的细胞。后续持续使用维持培养基（F12K培养基含10%胎牛血清及400 μg/ml GENETICIN）培养细胞。定期使用冷冻培养基（含20% DMSO的筛选培养基）按1:1比例冷冻保存细胞系，以防意外污染导致细胞丢失。
  9. 克隆细胞系筛选：首先，按照步骤1.3操作，用维持培养基对步骤1.8所得细胞进行胰蛋白酶消化和离心。用5 ml维持培养基重悬细胞，取0.5 ml细胞悬液加入4.5 ml新鲜维持培养基中，制成10倍稀释液。将该10倍稀释液转移至96孔板的12个孔中，每孔加100 μl，用于单细胞筛选。
  10. 继续对该细胞悬液进行10倍系列稀释，理论上最终获得每100 μl含一个细胞的悬液（通常最终稀释倍数在10-11至10-19之间；总10倍稀释次数约为˜19）。每次稀释后立即取100 μl加入96孔板的12个新孔中。孵育18小时后，在倒置光学或荧光显微镜下观察96孔板，标记仅含单个细胞或明显由单个细胞分裂而来的两个细胞的孔。持续每日观察，并每三天更换一次培养基。
  11. 当孔内细胞汇合度达80%（约一周后），用200 μl PBS清洗标记的孔，加入100 μl PBS-胰蛋白酶-EDTA溶液进行消化。将每个标记孔中的细胞转移至6孔板的一个孔中，加入1 ml维持培养基。培养3天后，将细胞转移至单独的T25培养瓶中。使用钙离子荧光素酶生物发光检测法对这些细胞进行激动剂肽检测（参见第2节）。
  12. 从步骤1.11中选择在钙离子荧光素酶生物发光板检测中反应最强的一个细胞系，并重复进行一次单细胞筛选（步骤1.9–1.11）。定期冷冻保存细胞系。
  13. 根据步骤1.12所述的二次筛选结果，选择在钙离子荧光素酶生物发光板检测中反应最强的2–3个细胞系，继续在培养中维持，用于后续的钙离子荧光素酶生物发光板检测。记录细胞传代次数。定期冻存早期传代的细胞系，以便在高传代细胞系性能不稳定时可回溯使用。

2. 钙离子生物发光板检测法

  1. 将目的报告基因连接至表达载体中。此处我们使用了aequorin质粒mtAEQ/pcDNA1（由丹麦哥本哈根大学的C. J. P. Grimmelikhuijzen博士和Michael Williamson博士惠赠）。将质粒转化至 E. coli 使用 MC1061/PS 细胞（Invitrogen）并利用 QIAprep spin miniprep 试剂盒（Qiagen Inc.）进行质粒纯化。最后一步使用不含 EDTA 的 Tris 缓冲液洗脱质粒，而非水。
  2. 培养第1.13步中表达目标受体的细胞系，使用维持培养基进行培养。当细胞融合度达到90%时，用胰蛋白酶消化，离心后将细胞重悬于5 ml维持培养基中，操作同第1.3步。用维持培养基将细胞稀释约10倍，使用细胞计数器（Bright-Line 血细胞计数板）在显微镜下计数细胞数量。调整细胞密度至约2 × 10⁶ 个/ml。5 细胞/毫升（血细胞计数板中9个方格之一平均有20个细胞）。将2毫升稀释后的细胞悬液接种至6孔板的每个孔中。培养24小时（培养后细胞汇合度应达到约60%）。
  3. 在6孔板中将培养基更换为OPTI-MEM培养基。每孔加入时，混合 96 μl 含 OPTI-MEM 的 4 μl FuGENE 6 转染试剂（Roche Biochemicals）于微量离心管中，室温静置 5 分钟。加入 1 μg 将等量的aequorin/pcDNA 1质粒DNA加入各离心管中，轻轻振荡混匀1分钟，室温孵育15–20分钟。将各混合物逐滴加入各孔中，同时轻柔振荡培养板。将培养板孵育6小时后，更换为含10%胎牛血清但不含抗生素的F12K培养基。
  4. 在六孔板中培养细胞 24 小时后，按照步骤 1.3 进行胰酶消化、离心并重悬细胞。按照步骤 2.1 将细胞数目调整至 400,000 个细胞/ml，并转移 100 μl （共 40,000 个细胞/100 μl)加入至96孔白色底透微孔板（Costar 3610）的每个孔中。继续孵育24小时，直至细胞融合度达到约80%。此为生物发光检测的最佳细胞浓度。
  5. 准备 90μl/well 无钙 DMEM 培养基（Invitrogen） 5 μM 腔肠素（Invitrogen）避光使用（腔肠素对光敏感）。 取步骤2.4中的培养板，吸除旧培养基后加入此溶液 90μl 每孔中加入。在避光条件下孵育平板 3 小时，温度为 37°C 和 5% CO2，此后培养板中的细胞即可用于检测。

3. 仪器操作与数据分析

  1. 每台生物发光酶标仪均有所不同。我们使用 NOVOstar（BMG Labtechnologies）酶标仪在生物发光模式下进行检测。如果您使用不同的仪器，则必须对本方案进行相应调整。
  2. 使用前请先对酶标仪的泵系统进行排空（或“PRIME PUMPS”）。将微孔板放入板架前，请关闭房间内的灯光。待板架关闭后，再打开灯光。
  3. 在无钙 DMEM 培养基中溶解肽（置于 1.5 ml Eppendorf 管中）。使用前设定肽溶液的“吸液深度”和“位置确定”参数。向细胞中加入 10 μl 不同浓度的肽（10 倍浓缩液，如 FFFSWG-NH2、Aedes-K1-3 或其他目标肽）进行刺激，并立即开始记录发光信号。我们将仪器设置为每 2 秒记录一次各孔的光发射信号（465 nm），总时长为 50 秒。
  4. 务必设置阳性对照，例如活性类似物（如已使用的类似物 FFFSWGa，Taneja-Bageshwar et al., 2009），以及阴性对照，例如仅转染空载体的细胞。阴性对照在数据分析过程中用于设定基线阈值（参见代表性结果）。也可添加一种无关的非活性肽作为阴性对照。
  5. 运行结束后，清洗仪器泵系统（或“PRIME PUMPS”），然后放入下一个肽样品。保存数据后再次清洗泵系统。
  6. 数据处理：将各孔的光发射数据导入 Microsoft Excel 表格中。
  7. 将 Excel 中的数据粘贴至 GraphPad Software Inc.（美国加利福尼亚州圣地亚哥）的 Prism 软件 4.0 版本中。以不同肽浓度为 X 轴，以生物发光单位为 Y 轴。为归一化数据，绘制对数-反应曲线。选择非线性回归曲线拟合分析（采用可变斜率的 S 形剂量-反应方程），以获得每种肽的浓度-反应曲线。程序最终绘出曲线并给出 EC50 值。
  8. 每次实验应至少重复三次，用于数据分析。

4. 代表性结果：

在CHO-K1细胞中表达时，埃及伊蚊（Aedes aegypti）激肽受体表现为一种多配体受体，在钙生物发光板检测中，单独测试的三种内源性伊蚊激肽（Aedae激肽1-3）在低至1 nM的浓度下即可产生功能性反应。图1显示，根据各自的EC50值，其效力排序为Aedae-K-3 > Aedae-K-2 > Aedae-K-1，其中Aedae-K-3为16.04 nM，Aedae-K-2为26.6 nM，Aedae-K-1为48.85 nM，三者之间的差异具有统计学显著性（P < 0.05）（Pietrantonio et al., 2005）。

我们还利用该实验确定了哪些缓激肽残基对缓激肽-受体相互作用至关重要。昆虫缓激肽类肽具有一个C端五肽，代表发挥生物学活性所需的最小序列，也称为核心序列。在表1中，缓激肽核心类似物以丙氨酸逐步取代核心五肽FFSWGa中的各个氨基酸进行合成，并通过钙依赖性生物发光板式检测法进行测试（Taneja-Bageshwar et al., 2006）。我们发现，Phe1 和 Trp4 这两个氨基酸对两种受体中昆虫缓激肽的活性均至关重要。

该检测方法还可用于测试设计用于增强生物稳定性的肽。表2显示了在蜱虫重组激肽受体上测试的含α-氨基异丁酸（Aib）的合成激肽类似物，图2展示了通过钙依赖性生物发光板检测法（Taneja-Bageshwar et al., 2009）测定的六种α-氨基异丁酸类似物在表达蜱虫激肽受体的CHO-K1细胞系中的活性比较。六肽类似物FFFSWGa作为受体活性的阳性对照加入。类似物FF[Aib]WGa的活性高于该六肽对照类似物。含有两个α-氨基异丁酸替换的类似物[Aib]FF[Aib]WGa在所有测试的双替换类似物中活性最强（表2和图2）。

有关该检测方法已应用和可应用的更多示例，请参见 Nachman 和 Pietantonio (2010)、Nachman et al. (2009)、Taneja-Bageshwar et al. (2008a) 以及 Taneja-Bageshwar et al. (2008b)。

埃及伊蚊激肽剂量-反应曲线及EC50值；科研结果分析，生物测定数据研究。
图1. 估计 伊蚊 激肽有效浓度（EC50通过钙-生物发光板式检测法检测CHO-K1 E10细胞。 浓度-反应曲线的纵轴数据来自以各肽段最大反应为100%的相对发光单位百分比。数据点表示三次独立实验中六次重复的平均值，误差线表示标准误。(A) Aedae-K1 EC50 = 48 nM。（B）Aedae-K2 EC的估计值50 = 26 nM。（C）Aedae-K3 EC₅₀ 的估算50 = 16 nM。EC50 Aedae-K3 < EC50 Aedae-K2 < EC50 Aedae-K1；P < 0.05。统计分析和图表采用 GraphPad Prism 4.0 软件完成。

显示类似物EC50值的生物发光剂量-反应曲线，以最大发光百分比表示。
图2. 通过钙依赖性生物发光板法比较六种α-氨基异丁酸类似物在表达蜱虫激肽受体的CHO-K1细胞系中的活性。 Y轴表示每种类似物的最大生物发光单位百分比，即在某一浓度下观察到的生物发光信号相对于该类似物在所有测试浓度中所达到的最大反应的百分比。统计分析和图形绘制使用GraphPad Prism 4.0软件完成。

 蜱受体细胞系蚊受体细胞系
肽EC50 (nM)1 mM 时的最大生物发光反应EC50 (nM)1 mM 时的最大生物发光反应
AFSWGaIIII
FASWGa5865,600 N.D. 400
FFAWGa64 12,800 621 3,050
FFSAGaIIII
FFSWAa41710,600 2,800 1,830
FFSWGa59010,800 N.D. 525
FSWGaIIII
FFSWaIIII
FFSWG-OHIIII
FFFSWGa25913,00056210,000
FF[Aib]WGa2912,700 445 9,300

表1. 所有测试肽在蜱和蚊受体转染细胞系上的估计效价（EC50）及最大生物发光反应*。

*EC50 估算诱导半数最大反应所需的浓度。I：无活性，若生物发光反应低于300单位（空载体转染细胞的水平）。A：肽FFSWGa中相应残基被丙氨酸取代的位置。N.D.：该类似物已进行测试，但在较低摩尔浓度下活性较弱或无活性，因此无法确定EC50。

K-Aib-1 [Aib]FF[Aib]WGa
K-Aib-2 [α MeF]FF[Aib]WGa
K-Aib-3 Ac-R[Aib]FF[Aib]WGa
K-Aib-4 Ac-R[β3F]FF[Aib]WGa
K-Aib-5 [Aib]RFF[Aib]WGa
K-Aib-6 [Aib-Aib-Aib-Aib]RFF[Aib]WGa

表2. 在蜱虫重组激肽受体上测试的含氨基异丁酸（Aib）的激肽类似物（K）。Ac：乙酰基；α Me：α-甲基苯丙氨酸；β3F：β3-苯丙氨酸；a：酰胺。

讨论

我们利用本方案成功完成了首个从蛛形纲（蜱、螨和蜘蛛）中发现的神经肽受体——蜱激肽受体的功能表征。该方法具有三个主要应用：第一，可通过配体活性测定实现受体去孤儿化；第二，该检测方法可用于解析配体-受体的构效关系（SAR）；第三，该方法可用于药物发现。此外，本方案还可用于研究激动剂或拮抗剂对几乎所有G蛋白偶联受体（GPCR）的活性。我们正在开始将该方案应用于小型文库的筛选。我们所使用的细胞系不表达普遍存在的G蛋白G16，而无需使用该蛋白，因为节肢动物激肽受体通过Gq蛋白及细胞内钙信号级联通路进行信号传导，且如本研究所示，其在哺乳动物细胞中仍保留了这一信号特性。

致谢

我们感谢丹麦哥本哈根大学的 C. J. P. Grimmelikhuijzen 博士和 Michael Williamson 博士提供 aequorin 质粒。同时感谢我们的合作者，美国农业部农业研究局（德克萨斯州，美国）的 Ronald J. Nachman 博士提供肽段合成服务以及 NOVOstar 酶标仪。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DMEMInvitrogenABCD1234
CHO-K1 细胞ATCCCCL-61美国弗吉尼亚州马纳萨斯
F12K 培养基Invitrogen21127
胎牛血清Sigma-AldrichF0643
胰蛋白酶-EDTA（10倍浓度）Invitrogen15400
抗生素-抗真菌剂Invitrogen15240
Opti-MEM I 低血清培养基Invitrogen31985
Lipofectin 转染试剂Invitrogen18292-011
GENETICINInvitrogen10131035
MC1061/P3 UltracompInvitrogenC663-03
QIAprep 质粒小提试剂盒Qiagen19064
FuGENE 6 转染试剂Roche Group11 814 443 001
96 孔白色平底微孔板Costar3610
无钙 DMEM 培养基Invitrogen21068
C–腔肠素InvitrogenC-2944
Bright-Line 血细胞计数板Hausser Scientific美国宾夕法尼亚州霍舍姆
NOVOstarBMG Labtechnologies
Prism 软件 4.0GraphPad Software Inc.美国加利福尼亚州圣地亚哥
T-25 和 T-75 培养瓶BD Biosciences353014 和 353135

参考文献

  1. Kozak, M. An analysis of 5'-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs. Nucleic Acids Research. 15, 8125-8148 (1987).
  2. Nachman, R., Pietrantonio, P. V. Interaction of mimetic analogs of insect kinin neuropeptides with arthropod receptors. Neuropeptide systems as Targets for Parasite and Pest Control. Geary, T. , Landes Bioscience. Madamme Curie Library. (2010).
  3. Nachman, R. J., Pietrantonio, P. V., Coast, G. M. Towards the development of novel pest management agents based upon insect kinin neuropeptide analogs. Annals of the New York Academy of Sciences. , 1163-11251 (2009).
  4. Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Isaac, R. E., Coast, G. M., Zubrzak, P., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. Biostable agonists that match and/or exceed the activity of insect kinins on recombinant arthropod GPCRs. General and Comparative Endocrinology. 162, 122-128 (2009).
  5. Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Kaczmarek, K., Zabrocki, J., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. Comparison of insect kinin analogs with cis-peptide bond, type VI-turn motifs identifies optimal stereochemistry for interaction with a recombinant arthropod kinin receptor from the southern cattle tick Boophilus microplus. Peptides. 29, 295-301 Forthcoming.
  6. Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Zubrzak, P., Williams, H., Reyes-Rangel, G., Juaristi, E., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. Identification of selective and non-selective, biostable beta-amino acid agonists of recombinant insect kinin receptors from the southern cattle tick Boophilus microplus and mosquito Aedes aegypti. Peptides. 29, 302-309 Forthcoming.
  7. Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Zubrzak, P., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. Comparative structure-activity analysis of insect kinin core analogs on recombinant kinin receptors drom southern cattle tick Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) and mosquito Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 62, 128-140 (2006).
  8. Pietrantonio, P. V., Jagge, C., Taneja-Bageshwar, S., Nachman, R. J., Barhoumi, R. The mosquito Aedes aegypti (L.) leucokinin receptor is a multiligand receptor for the three Aedes kinins. Insect Molecular Biology. 14, 55-67 (2005).
  9. Holmes, S. P., Barhoumi, R., Nachman, R. J., Pietrantonio, P. V. Functional analysis of a G protein-coupled receptor from the Southern cattle tick Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) identifies it as the first arthropod myokinin receptor. Insect Molecular Biology. 12, 27-38 (2003).
  10. Staubli, F., Jorgensen, T. J. D., Cazzamali, G., Williamson, M., Lenz, C., Sondergaard, L., Roepstorff, P., Grimmelikhuijzen, C. J. P. Molecular identification of the insect adipokinetic hormone receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 99, 3446-3451 (2002).
  11. Stables, J., Green, A., Marshall, F., Fraser, N., Knight, E., Sautel, M., Milligan, G., Lee, M., Rees, S. A bioluminescent assay for agonist activity at potentially any G-protein coupled receptor. Analytical Biochemistry. 252, 115-126 (1997).

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