通过电解诱导下腔静脉内表面内皮细胞活化，可导致静脉型血栓形成，其机制涉及内皮细胞活化和部分血流淤滞，这两者均为维尔肖三联征的组成部分。
本文内容
摘要
摘要
动物模型在深静脉血栓（DVT）研究中发挥着至关重要的作用，可用于研究血栓形成、血栓溶解以及测试潜在的治疗化合物（1）。目前，正在开发用于DVT治疗和预防的新化合物。将潜在的治疗性拮抗化合物递送至受累的血栓静脉一直存在困难。在治疗应用背景下，一种利用部分血流停滞并能在主要静脉内稳定生成血栓的模型 recently established。电解性下腔静脉模型（EIM）是一种允许在持续血流存在条件下形成血栓的DVT小鼠模型。该模型使治疗剂能够以动态方式与血栓接触，且比其他DVT模型更为敏感（1）。此外，该血栓形成模型 closely simulates 临床血栓形成的实际情况，是研究静脉内皮细胞活化、白细胞迁移、静脉血栓形成机制以及测试治疗应用的理想选择（1）。EIM模型技术操作简单，易于重复，可产生大小一致的血栓，并能获得较大的样本量（即血栓和静脉壁），满足分析需求。
方案
1. 小鼠麻醉操作
- 将动物从笼中取出，放入麻醉前诱导室，以 0.5 升/分钟的流速（通过蒸发器控制）吸入 2% 异氟烷和 100% 氧气进行气体麻醉诱导。
- 小鼠在麻醉诱导室中镇静后，从室内取出，使用电推剪剃除腹侧腹部毛发；若使用脱毛剂，则小鼠保留在诱导室内（1 分钟）。
- 在持续镇静状态下，称重小鼠，用无菌眼膏润滑眼睛，然后将其仰卧位置于循环温水加热装置上，在通过鼻罩给予异氟烷和氧气的全身麻醉下进行操作。此时，氧气流速降至 0.2 升/分钟。
- 用氯己定溶液喷洒腹部（二乙酸氯己定具有快速杀菌和持久作用），并用无菌纱布擦拭三次，直至手术区域清洁。
2. 小鼠显微外科及术后恢复操作
- 使用虹膜剪在皮肤和腹壁上做一条2 cm的腹正中切口，暴露腹腔。用无菌生理盐水浸湿的2×2纱布将肠管推向动物左侧。放置小鼠固定器，以便观察下腔静脉（IVC）。
- 此时将异氟烷浓度降低至维持水平（2%），氧气流速保持在0.2升/分钟，直至手术结束。
- 使用无菌棉签和超精细虹膜半弯组织镊进行钝性分离。操作小鼠组织时需格外小心，因其极为脆弱。
- 从肾静脉至髂总分叉之间的所有下腔静脉侧支均用7-0非反应性聚丙烯缝线结扎，而后侧支保持开放。
- 在电解诱导下腔静脉血栓模型（EIM）中，将连接至镀银铜线（KY-30-1-GRN, Electrospec, Dover, NJ）的25G不锈钢针插入暴露的尾端下腔静脉（见图1），并紧贴前壁放置（作为阳极）。
- 另一根导线皮下植入，以完成电路（作为阴极）。
- 使用Grass S48方波刺激器和恒流单元（Grass Technologies, An Astro-Med, Inc., West Warwick, RI）施加250 μA电流，持续15分钟。直流电流导致电解产物生成，这些毒性产物腐蚀下腔静脉内皮表面，促进血栓形成环境，进而引发血栓形成。
- 15分钟后取出针头，并用棉签轻压穿刺部位以防止出血。
- 在假手术组动物中，将针插入下腔静脉后立即拔出，不施加电流。
- 腹壁切口采用两层缝合法关闭。本实验室使用5-0薇乔线（合成缝线）连续缝合关闭腹壁，皮肤则使用医用粘合剂闭合，无需留置体表缝线，术后无需拆线。
- 术后小鼠置于独立笼具中恢复，在加热灯下密切观察45分钟至2小时（加热灯与笼具最小距离为24英寸），随后返回原饲养单元。若不影响研究目的，可使用镇痛药和抗炎药物。如需不给予镇痛药物，须提供科学依据，并获得兽医及IACUC批准。本实验室发现，皮下注射布托啡诺（Buprenorphine）0.05–0.1 mg/kg是小鼠术前和术后优良的镇痛方案。此外，当全身性镇痛可能干扰实验结果时，可在切口部位注射利多卡因（4 mg/kg，即1%溶液0.4 ml/kg）进行局部镇痛。
- 我们通常未观察到因深静脉血栓（DVT）导致的术后不良反应。然而，可能的术后并发症包括麻醉意外死亡、术中失血以及因神经损伤导致的部分轻瘫。恢复缓慢的动物可给予营养凝胶或将湿润饲料置于笼底以促进恢复。出现严重术后并发症的动物应实施人道安乐死。
- 在预定时间点，依据美国兽医协会（AVMA）《啮齿类动物安乐死指南》推荐的方法实施人道安乐死。
3. 典型结果
EIM 是一种在持续血流条件下形成血栓的模型。下图展示了在此新型模型中研究的各项参数。
图 1 展示了插入连接银镀铜线的25G不锈钢针（KY-30-1-GRN，Electrospec，美国新泽西州多佛）的解剖区域。请注意，几乎总存在一个淋巴结，可作为定位尾侧下腔静脉的解剖标志。
图 2：不同品系小鼠在EIM后2天的血栓重量。如预期所示，PAI-1基因敲除（KO）小鼠的血栓重量较低，而高凝状态的Delta CT小鼠（^CT）血栓重量较大。
图3：可溶性P-选择素是深静脉血栓形成的标志物，在不同小鼠品系中进行了检测。其中，PAI-1基因敲除小鼠的水平最低，而高凝状态的delta CT小鼠的水平最高。
图4 在不同品系中均发现血栓重量与可溶性P-选择素之间存在相关性。值得注意的是，在形成较小血栓的组别中，检测到的可溶性P-选择素水平最低（PAI-1基因敲除小鼠）。而在形成最大血栓的组别中，检测到的可溶性P-选择素水平最高（高凝状态delta CT小鼠）。
图 5：为了证实血流的存在，在接受电诱导损伤（EIM）的小鼠中进行了超声成像。图 5 显示了小鼠在 EIM 后第 2 天的超声检查结果，随后采集了标本。请注意，血栓的形态提示其在血流存在的情况下形成
讨论
小鼠是进行体内实验的优良研究工具，因此有必要建立能够紧密模拟疾病或病理状态的小鼠模型。目前已采用多种静脉血栓小鼠模型来研究深静脉血栓（DVT），包括：光化学法（2）、血流停滞法（3-4）和机械损伤法（5-6）。然而，这些模型均未在持续血流存在的情况下，利用血管内皮刺激来诱导血栓形成。EIM模型通过在下腔静脉（IVC）内施加电解刺激，在血流持续存在的条件下通过内皮细胞活化促进静脉血栓形成（1）。该模型技术操作简便，可重复性高，且具有高达99%的存活率。尽管使用电流引发电解反应，但并不会产生热量（1）。EIM模型能够较好地模拟临床DVT，因此是研究血栓形成与溶解内在机制的有力工具，同时也适用于推动抗血栓新疗法的发展。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
由美国国立卫生研究院（NIH）1P01HL089407-01A1（Lawrence，项目负责人）、动物核心A及NIH 1K01HL080962-01A2（Myers，项目负责人）资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM | 英维特罗根 | ABCD1234 |
参考文献
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