一种用于鉴定优先级细菌病原体的简单方法是使用基因工程改造的报告噬菌体。这些报告噬菌体对其特定宿主菌种具有专一性，能够迅速将生物发光信号转导至宿主细胞。本文描述了利用报告噬菌体检测Yersinia pestis的方法。
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摘要
摘要
Yersinia pestis 和 Bacillus anthracis 属于A类细菌病原体，分别为鼠疫和炭疽的致病菌1。尽管这两种疾病在自然界中的发生率目前相对较低，但恐怖组织将这些病原体用作生物武器的可能性是真实存在的。由于这些疾病具有固有的传染性、快速的临床进程以及高死亡率，迅速发现疫情暴发至关重要。因此，必须采用能够实现快速检测与诊断的技术方法，以确保及时实施公共卫生措施并启动危机管理机制。
重组报告噬菌体可能为检测提供一种快速且特异的方法 Y. pestis 和 B. anthracis 美国疾病控制与预防中心目前采用经典的噬菌体裂解试验来确证这些细菌病原体 2-4这些检测方法利用了天然存在的噬菌体，这些噬菌体对其特定的细菌宿主具有专一性和裂解性。在特定噬菌体存在下对培养的细菌进行过夜培养后，噬菌斑（细菌裂解区域）的形成可作为细菌靶标的阳性鉴定依据。尽管这些检测方法具有良好的可靠性，但仍存在三个局限性：1）需在实验室中进行；2）需要从可疑样本中分离并培养细菌；3）完成检测需耗时24–36小时。为解决这些问题，研究人员通过将 Vibrio harveyi luxAB 基因组中的基因 Y. pestis 和 B. anthracis 特异性噬菌体 5-8. 所得结果 luxAB 报告噬菌体能够通过快速（数分钟内）且灵敏地赋予受体细胞生物发光表型，从而特异性地检测其目标。重要的是，该检测既可在培养的受体细胞中实现，也可在模拟感染的临床样本中完成。 7.
为演示目的，本文描述了利用噬菌体检测已知目标的方法 Y. pestis 使用以下方法分离 luxAB 由美国疾病控制与预防中心（CDC）鼠疫诊断噬菌体ΦA1122构建的报告噬菌体 6,7 （图1）。一种类似的方法，经微小修改（例如培养温度和培养基的改变），可用于检测 B. anthracis 使用以下方法分离菌株 B. anthracis 报告噬菌体 Wβ::luxAB 8. 该方法描述了通过噬菌体介导将生物发光表型转导至培养物中的过程 Y. pestis 使用微量板发光仪对后续的细胞进行测量。与传统的噬菌体裂解实验相比，该方法的主要优势在于操作简便、结果快速，以及能够在96孔微量板中同时检测多个样品。
图 1. 检测示意图。 将噬菌体与样品混合，噬菌体感染细胞，表达 luxAB，细胞产生生物发光。无需样品前处理；将噬菌体与细胞混合后直接检测发光信号。
方案
1. Y. pestis 平板接种
- 划线 Y. pestis A1122（BeiResources # NR15）菌种接种至Luria-Bertani（LB）琼脂（Miller）培养基。采用无菌操作技术，所有步骤均需在无菌条件下进行 Y. pestis 在II类A型生物安全柜中进行操作。 Y. pestis A1122 是一种生物安全等级（BSL）2 级的豁免选定试剂菌株。它缺失了 75 kb 的低钙反应（Lcr）毒力质粒以及 pgm 毒力所必需的基因位点。培养 Y. pestis 在 28°C 在静态温控空气培养箱中培养48小时。细胞的生长速率 Y. pestis 代时较长，为1.25小时 9.
2. Y. pestis 液体培养基接种
- 使用无菌金属接种环，将单个 Y. pestis 菌落转移至含有 2 mL LB 肉汤的无菌 17 x 100 mm 培养管中。选择大小均一、形态典型且与其他菌落明显分离的菌落。短暂涡旋混匀后，于 28°C 摇床培养箱（225 rpm）中培养约 20 小时。
3. Y. pestis 菌体复苏、报告噬菌体添加及生物发光检测
- 将过夜培养的 Y. pestis 菌液按1:20比例稀释至新鲜LB肉汤中（例如，将500 μL菌液加入9.5 mL培养基），置于50 mL Falcon管中，于28°C、225 rpm振荡培养，直至600 nm处光密度（A600）达到0.2（约5小时）。建议使用处于活跃生长期的菌体进行检测，因为噬菌体诱导产生生物发光反应的能力与宿主细菌的活力和适应性密切相关。然而，已有研究表明，该检测系统也可兼容生长周期各阶段收获的菌体7。
- 通过配制2%正癸醛溶液，制备生物发光反应所需的底物。将200 μL正癸醛与9.8 mL LB肉汤混合，剧烈涡旋5秒。用2 mL 2%正癸醛溶液预填充微孔板发光仪的注射器。预先设定发光仪自动向每孔注入67 μL正癸醛溶液，并立即读取样品发光信号10秒。
- 将LB肉汤按每份1 mL分装至3支培养管中。向每管中加入20 μL报告噬菌体储备液（储备液浓度为5 × 109斑块形成单位[PFU]/mL）；仅含噬菌体与培养基的样品作为阴性对照。在无Y. pestis菌体存在时，加入报告噬菌体不应引发生物发光反应。
- 将步骤3.1中培养的Y. pestis菌液按每份1 mL分装至6支培养管中。向其中3管加入20 μL报告噬菌体储备液（检测培养物）。剩余3管作为“仅菌体”阴性对照（背景自发生物发光）。短暂涡旋混匀各培养物后，从每份样品中取200 μL（用于0时间点读数），加入白色96孔微孔板中。将剩余培养物置于28°C、225 rpm振荡培养。
- 使用微孔板发光仪测定0时间点样品的生物发光值（相对光单位，RLU）。
- 在加入报告噬菌体后的10、20、30、40、50和60分钟，分别从各样品中取200 μL，测定其生物发光值。若存在Y. pestis菌体，报告噬菌体会特异性结合菌体，注入其DNA，并利用宿主的转录与翻译系统表达luxAB报告基因（图1）。
- 信号强度及响应时间与菌体数量成正比。在高浓度菌体（105–108 CFU/mL）条件下，与对照相比，RLU值在20分钟内应出现显著升高；在较低菌体浓度（102–104 CFU/mL）条件下，RLU值的显著升高应在40–60分钟内显现。
- 另可采用快速检测方法：无需进行Y. pestis扩增培养，可直接从新鲜培养的平板上挑取单菌落，加入含报告噬菌体的200 μL LB肉汤中，于1.5 mL离心管中涡旋混匀。将菌体/噬菌体混合液加入微孔板孔中，于28°C孵育，并在60分钟后（仅单时间点）测定其生物发光值。
4. 代表性结果：
图2展示了报告噬菌体介导检测Y. pestis的典型时间过程实验。阴性对照组包括：1）仅含噬菌体（无细胞）或2）仅含细胞（无噬菌体），在60分钟孵育期间其生物发光水平基本维持在约20 RLU（基础值因 luminometer 而异）。相比之下，检测样本（报告噬菌体与细胞）在加入噬菌体后15分钟即可观察到生物发光信号的明显上升。信号强度应在60分钟内持续稳定增强。若孵育时间过长（超过80分钟），由于噬菌体介导的宿主细胞裂解，信号将从峰值开始下降。在37°C孵育条件下也可获得类似结果，尽管Y. pestis生长的最适温度为28°C9。
图2. 噬菌体介导的Y. pestis生物发光检测。 在0时刻将报告噬菌体与细胞混合，在28°C下孵育，并随时间监测生物发光信号（RLU）。15分钟内即可观察到RLU显著增加（* 学生t检验，p<0.05）。
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讨论
该方法展示了报告噬菌体快速检测鼠疫耶尔森菌（Y. pestis）的能力，因为报告噬菌体在加入噬菌体后20分钟内即可对培养的鼠疫耶尔森菌（Y. pestis）细胞产生生物发光信号响应。该报告噬菌体还能够在临床样本基质中直接检测鼠疫耶尔森菌（Y. pestis），无需预先进行分离和后续培养7。与通常需要48小时才能完成的标准噬菌体裂解试验相比，该方法显著缩短了检测时间。
既往研究表明，野生型ΦA1122噬菌体能够裂解几乎所有天然的Y. pestis分离株，并且对Y. pestis具有“特异性”6,10,11；然而，某些Y. pseudotuberculosis菌株在温度高于20°C时培养已被证实对ΦA1122敏感6,10,12。这种温度敏感性差异易感性的原因尚不明确，但可能与细胞表面结构/成分的温度依赖性变化有关。因此，报告噬菌体检测系统的一个潜在局限性是可能与近缘物种Y. pseudotuberculos...
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致谢
本研究由美国国立卫生研究院的小企业创新研究计划（NIAID，1R43AI082698-01）和美国农业部国家食品与农业研究所（NIFA，2009-33610-20028）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Difco LB 琼脂，Miller | VWR international | 90003-346 | |
| Difco LB 肉汤，Miller | VWR international | 90003-350 | |
| 17 x 100 mm 培养管 | USA Scientific, Inc. | 1485-0810 | |
| n-癸醛 | Sigma-Aldrich | D7384 | |
| Veritas 微孔板发光仪 | Turner Biosystems | 9100-001 | |
| Microlite 96 孔微量滴定板 | VWR international | 62402-984 |
参考文献
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