一种用于鉴定优先级细菌病原体的简单方法是使用基因工程改造的报告噬菌体。这些报告噬菌体对其特定宿主菌种具有专一性，能够迅速将生物发光信号转导至宿主细胞。本文描述了利用报告噬菌体检测Yersinia pestis的方法。
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摘要
摘要
Yersinia pestis 和 Bacillus anthracis 属于A类细菌病原体，分别为鼠疫和炭疽的致病菌1。尽管这两种疾病在自然界中的发生率目前相对较低，但恐怖组织将这些病原体用作生物武器的可能性是真实存在的。由于这些疾病具有固有的传染性、快速的临床进程以及高死亡率，迅速发现疫情暴发至关重要。因此，必须采用能够实现快速检测与诊断的技术方法，以确保及时实施公共卫生措施并启动危机管理机制。
重组报告噬菌体可能为检测提供一种快速且特异的方法 Y. pestis 和 B. anthracis 美国疾病控制与预防中心目前采用经典的噬菌体裂解试验来确证这些细菌病原体 2-4这些检测方法利用了天然存在的噬菌体，这些噬菌体对其特定的细菌宿主具有专一性和裂解性。在特定噬菌体存在下对培养的细菌进行过夜培养后，噬菌斑（细菌裂解区域）的形成可作为细菌靶标的阳性鉴定依据。尽管这些检测方法具有良好的可靠性，但仍存在三个局限性：1）需在实验室中进行；2）需要从可疑样本中分离并培养细菌；3）完成检测需耗时24–36小时。为解决这些问题，研究人员通过将 Vibrio harveyi luxAB 基因组中的基因 Y. pestis 和 B. anthracis 特异性噬菌体 5-8. 所得结果 luxAB 报告噬菌体能够通过快速（数分钟内）且灵敏地赋予受体细胞生物发光表型，从而特异性地检测其目标。重要的是，该检测既可在培养的受体细胞中实现，也可在模拟感染的临床样本中完成。 7.
为演示目的，本文描述了利用噬菌体检测已知目标的方法 Y. pestis 使用以下方法分离 luxAB 由美国疾病控制与预防中心（CDC）鼠疫诊断噬菌体ΦA1122构建的报告噬菌体 6,7 （图1）。一种类似的方法，经微小修改（例如培养温度和培养基的改变），可用于检测 B. anthracis 使用以下方法分离菌株 B. anthracis 报告噬菌体 Wβ::luxAB 8. 该方法描述了通过噬菌体介导将生物发光表型转导至培养物中的过程 Y. pestis 使用微量板发光仪对后续的细胞进行测量。与传统的噬菌体裂解实验相比，该方法的主要优势在于操作简便、结果快速，以及能够在96孔微量板中同时检测多个样品。
图 1. 检测示意图。 将噬菌体与样品混合，噬菌体感染细胞，表达 luxAB，细胞产生生物发光。无需样品前处理；将噬菌体与细胞混合后直接检测发光信号。
方案
1. Y. pestis 平板接种
- 划线 Y. pestis A1122（BeiResources # NR15）菌种接种至Luria-Bertani（LB）琼脂（Miller）培养基。采用无菌操作技术，所有步骤均需在无菌条件下进行 Y. pestis 在II类A型生物安全柜中进行操作。 Y. pestis A1122 是一种生物安全等级（BSL）2 级的豁免选定试剂菌株。它缺失了 75 kb 的低钙反应（Lcr）毒力质粒以及 pgm 毒力所必需的基因位点。培养 Y. pestis 在 28°C 在静态温控空气培养箱中培养48小时。细胞的生长速率 Y. pestis 代时较长，为1.25小时 9.
2. Y. pestis 液体培养基接种
- 使用无菌金属接种环，将单个 Y. pestis 菌落转移至含有 2 mL LB 肉汤的无菌 17 x 100 mm 培养管中。选择大小均一、形态典型且与其他菌落明显分离的菌落。短暂涡旋混匀后，于 28°C 摇床培养箱（225 rpm）中培养约 20 小时。
3. Y. pestis 菌体复苏、报告噬菌体添加及生物发光....
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讨论
该方法展示了报告噬菌体快速检测鼠疫耶尔森菌（Y. pestis）的能力，因为报告噬菌体在加入噬菌体后20分钟内即可对培养的鼠疫耶尔森菌（Y. pestis）细胞产生生物发光信号响应。该报告噬菌体还能够在临床样本基质中直接检测鼠疫耶尔森菌（Y. pestis），无需预先进行分离和后续培养7。与通常需要48小时才能完成的标准噬菌体裂解试验相比，该方法显著缩短了检测时间。
既往研究表明，野生型ΦA1122噬菌体能够裂解几乎所有天然的Y. pestis分离株，并且对Y. pestis具有“特异性”6,10,11；然而，某些Y. pseudotuberculosis菌株在温度高于20°C时培养已被证实对ΦA1122敏感6,10,12。这种温度敏感性差异易感性的原因尚不明确，但可能与细胞表面结构/成分的温度依赖性变化有关。因此，报告噬菌体检测系统的一个潜在局限性是可能与近缘物种Y. pseudotuberculos.......
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致谢
本研究由美国国立卫生研究院的小企业创新研究计划（NIAID，1R43AI082698-01）和美国农业部国家食品与农业研究所（NIFA，2009-33610-20028）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Difco LB 琼脂，Miller | VWR international | 90003-346 | |
| Difco LB 肉汤，Miller | VWR international | 90003-350 | |
| 17 x 100 mm 培养管 | USA Scientific, Inc. | 1485-0810 | |
| n-癸醛 | Sigma-Aldrich | D7384 | |
| Veritas 微孔板发光仪 | Turner Biosystems | 9100-001 | |
| Microlite 96 孔微量滴定板 | VWR international | 62402-984 |
参考文献
- Darling, R. G., Catlett, C. L., Huebner, K. D., Jarrett, D. G. Threats in bioterrorism. I: CDC category A agents. Emerg Med Clin North Am. 20, 273-309 (2002).
- Chu, M. C. Laboratory manual of plague diagnostic tests.. , Centers for Disease Control and Prevention. Atlanta. (2000).
- , (1999).
- Ingl....
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