脑浸润性白细胞的分离

摘要

介绍了一种从小鼠脑组织中快速获取浸润性白细胞的方法。该方法利用连续Percoll梯度和不连续Ficoll梯度，选择并纯化富含白细胞的组分层。分离得到的白细胞随后可通过流式细胞术进行表征分析。

摘要

我们描述了一种从小鼠中制备脑浸润性白细胞（BILs）的方法。我们展示了如何通过快速颅内注射技术将鼠脑心肌炎病毒（Theiler's murine encephalomyelitis virus, TMEV）感染小鼠，以及如何从全脑组织中纯化出富含白细胞的浸润细胞群体。简言之，将小鼠置于密闭舱内用异氟烷麻醉后，使用哈密尔顿注射器直接手动注射至额叶皮层。感染后不同时间点，通过过量异氟烷麻醉处死小鼠，取出全脑组织，并用Tenbroeck组织研磨器在RPMI培养基中进行匀浆。脑匀浆液经连续30% Percoll梯度离心，以去除髓鞘及其他细胞碎片。细胞悬液随后经40 μm细胞筛过滤，洗涤后在不连续Ficoll-Paque Plus梯度液中离心，以富集并纯化白细胞。所得白细胞经洗涤后重悬于适当缓冲液中，用于流式细胞术免疫表型分析。流式细胞术结果显示，在感染早期阶段，C57BL/6小鼠脑内存在一群天然免疫细胞。感染后24小时，BILs中出现多种免疫细胞亚群，其中以Gr1⁺、CD11b⁺和F4/80⁺细胞群体显著富集。因此，该方法适用于表征脑内急性感染过程中的免疫应答反应。

方案

1. 颅内病毒注射：

本实验技术已由本实验室及同行进行了修改并广泛使用。简言之，对年轻小鼠（优选5-6周龄）进行颅内注射Theiler's小鼠脑脊髓炎病毒Daniel株（TMEV）或假感染（1, 10），以诱导脑组织浸润性白细胞（BILs）的产生。请注意，Daniel株、BeAN株和GDVII株所获得的结果会有所不同。为获取BILs，小鼠接种2×10⁵ PFU的TMEV，并感染24小时。

1. 将注射针头（27 号，¼ 英寸，Kendall）连接至自动 1 ml Hamilton 注射器，并设定递送 10 μl 病毒液。
2. 小心吸取含 TMEV 的 10 μl DMEM 液体至注射器中，注意避免气泡产生。在适当情况下，假感染小鼠注射 10 μl 无病毒 DMEM。
3. 注射前，将约 1 mL 异氟烷倒入含有带棉垫底层金属网格的钟形罩内。
4. 将小鼠直接置于钟形罩内的金属网格上，直至其轻度麻醉，对足趾夹捏无反应且因吸入麻醉剂而固定不动，约需 10–15 秒。小鼠不应直接接触异氟烷，因该物质可能具有刺激性和腐蚀性。
5. 在麻醉状态下，通过剃毛和染色快速定位颅骨额叶皮层区域的适当坐标以准备注射。注射的一般位置为前囟前 1 mm，矢状缝右侧 1 mm 处（图 1）。尽管立体定位注射适用于某些实验情况，但我们发现大多数实验中无需剃毛或染色，采用徒手注射即可。沿两个轴方向用针尖分开毛发即可进行注射。
6. 进行注射时，使针头垂直于颅骨，压入骨内至约 3 mm 深度。
7. 按下 Hamilton 注射器按钮，将病毒注入脑内，注入后等待 2 秒，使病毒充分进入脑组织，再撤出针头。
8. 小心拔出针头，将小鼠放入清洁干燥的笼子中。小鼠从麻醉中苏醒迅速，数分钟内即可恢复正常活动。应密切关注出现异常症状的小鼠，例如注射部位大量出血，必要时应实施安乐死。必须遵循正确的动物操作规范⁶，并遵守美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）及机构动物护理与使用委员会（Institutional Animal Care and Use Committee）的指导方针。

2. 脑浸润白细胞制备：

1. 准备可容纳 30 ml 的圆底 Oak Ridge 离心管，每管中加入 10 ml RPMI 1640、9 ml Percoll 和 1 ml 10X PBS，在脑组织取出过程中将离心管置于室温台面上静置。
2. 将 Ficoll-Paque Plus 置于室温（RT）下。
3. 采用改良的异氟烷过量法处死动物 ⁵ 使用不锈钢组织刮匙迅速取出脑组织，置于预冷的含有5 ml RPMI的15 ml锥形管中，冰上保存。在某些情况下，可采用PBS灌注以清除BILs制备物中的循环外周血细胞。进行PBS灌注前，应确保小鼠已充分且正确地麻醉。
4. 将脑组织和RPMI溶液转移至7 ml玻璃Pyrex品牌Tenbroeck组织研磨器中，轻轻研磨10–15次。
5. 向匀浆器中再加入5 ml RPMI，上下吹打两次。将脑匀浆液（约10 ml）转移至预先准备好的圆底管中，轻轻倒置混匀2-3次。
6. 以7800g离心脑匀浆_平均值 在Beckman Allegra X-22R临床离心机中，使用F0360固定角转子，于室温下离心30分钟。
7. 离心后，去除漂浮在梯度顶部的髓鞘碎片。收集位于红细胞沉淀物上方的白细胞层（图2）。
8. 通过滤器分离白细胞层 40 μm 将细胞滤过液收集至50 ml离心管中，用RPMI培养基定容至50 ml。
9. 将含有稀释细胞悬液的离心管在临床离心机中以1500 rpm（600g）离心_平均值在室温下孵育5分钟。
10. 吸弃上清液，收集细胞沉淀。将沉淀重悬于1 ml FACS缓冲液（含1%牛血清白蛋白、0.02%叠氮化钠的无钙无镁PBS）中，并将细胞悬液转移至5 ml圆底FACS管中。
11. 小心地将1 ml Ficoll-Paque Plus铺在悬液下方。
12. 在室温下，使用临床离心机以2500 rpm（1400 × g）离心25分钟，不使用刹车。
13. 用1 ml移液器去除界面处的白色絮状层（图2），并转移至新的5 ml FACS管中。用4 ml FACS缓冲液洗涤细胞。
14. 以1500 rpm（600g）离心管子_平均值在临床离心机中于室温下离心5分钟以沉淀细胞。
15. 吸弃上清液，收集细胞沉淀。将白细胞沉淀重悬于适量缓冲液中，置于新的FACS管内，冰上保存。
16. 计数细胞，通过台盼蓝排斥法评估细胞活力，并进行流式细胞术分析。通常情况下，研究者可获得约 5 x 10⁵ 细胞/动物

3. 流式细胞术免疫表型分析

1. 分离并计数白细胞后，在临床离心机中以1500 rpm（600 _gave）离心3分钟。
2. 将细胞沉淀重悬于封闭缓冲液中，封闭缓冲液包含以下成分：FACS缓冲液、2.4G2杂交瘤上清液（Fc阻断剂；抗CD16/32）和胎牛血清，体积比为10:5:1，并在4°C孵育30分钟。
3. 制备针对细胞外抗原的偶联抗体，按1:200浓度加入已封闭的细胞中，避光并在4°C孵育30分钟。在96孔V型底板中，每孔使用200 μl体积进行染色和孵育。必要时设置未染色细胞和荧光补偿对照样本作为适当对照。
4. 将染色后的细胞在室温下使用适用于96孔板的转子，于临床离心机中以1500 rpm（600_gave）离心3分钟。
5. 吸除上清液，并用200 μl FACS缓冲液轻轻吹打重悬细胞3次进行洗涤。
6. 重复上述洗涤步骤两次。
7. 洗涤完成后，将细胞重悬于2%多聚甲醛中，并转移至FACS管。对于生物安全二级试剂处理的感染细胞，流式细胞术分析前必须进行固定。
8. 采用改良的流式细胞术方法在BD FACS Calibur仪器上检测固定后的细胞⁸，并使用FlowJo、WinMDI或其他可用的流式细胞术分析软件进行离线数据分析。
9. 通常每样本需分析50,000至100,000个事件，以获得充分的免疫表型鉴定结果。

本实验中使用的直接偶联抗体：

使用克隆株 30-F11 检测 CD45。使用克隆株 Gr1、RB6-8C5 检测 Ly6C/G。使用克隆株 M1/70 检测 CD11b。使用克隆株 BM8 检测 F4/80。

4. 代表性结果：

我们展示了小鼠BILs在感染后24小时的细胞表型分析结果（图3）。使用PerCP偶联的抗小鼠CD45抗体对白细胞进行染色以检测免疫细胞，使用PE偶联的抗小鼠Ly6C/G抗体检测炎性单核细胞，使用APC偶联的抗小鼠CD11b抗体和APC偶联的抗小鼠F4/80抗体检测单核细胞谱系细胞。分析采用BD FACS Calibur仪器进行。

图1. 注射位点的解剖定位。 注射位点位于前囟点前方1 mm、矢状缝右侧1 mm处。

图 2. 白细胞和BIL梯度分离示意图。 在Percoll梯度中，白细胞最初收集于髓鞘碎片层正下方、红细胞沉淀物上方。在Ficoll梯度中，界面处的白色絮状层（BIL）被收集。

图3. 感染后24小时脑浸润白细胞的免疫表型。小鼠脑组织中的白细胞通过差速密度离心法从颅内感染后24小时动物的组织匀浆中分离。细胞使用荧光标记的抗体对小鼠CD45、Ly6C/G、CD11b和F4/80进行染色。初步设门通过将免疫细胞标志物CD45与前向散射光（FSC，反映细胞大小）作图完成（C）。CD45^你好 （A，D），CD45^lo （B、E）和 CD45^阴性 （F，G）随后分析单核细胞和巨噬细胞标志物 Ly6C/G、F4/80（A，B，F）和 CD11b（D，E，G）的相对表达水平。Ly6C/G⁺F4/80⁺CD11b⁺ 炎症性单核细胞几乎 exclusively 存在于 CD45^你好 群体（A，D），与这些细胞从外周浸润一致。相比之下，Ly6C/G-F4/80^loCD11b⁺ 巨噬细胞几乎 exclusively 存在于 CD45^lo （B、E）和 CD45^阴性 （G）群体，与驻留表型一致。在多次实验中，我们从未观察到CD45^你好 细胞或 Ly6C/G⁺F4/80⁺CD11b⁺ 未感染或假感染小鼠脑内的炎性单核细胞（数据未显示）。

讨论

我们常规使用流式细胞术来评估脑部浸润细胞制备的质量，并区分不同类型的免疫细胞^{2, 9}。在急性期时间点，我们的BILs方法在CD45hi群体中获得较高比例的炎性单核细胞，同时在CD45lo群体中获得较高比例的巨噬细胞。这表明，通过我们的方法可稳定、可靠地表征脑内可重复的免疫反应。

该技术对于需要从小鼠脑组织中获取特征明确的免疫细胞群体的实验尤为重要。我们此前已通过尾静脉注射，将分离得到的脑浸润性白细胞转移至受体小鼠体内，成功开展了过继转移实验。 ⁷，并通过多种方法对BILs进行了表征 体外 实验 ⁹我们的BILs制备方法在需要区分脑内不同免疫细胞群体与常驻脑细胞（包括常驻巨噬细胞和小胶质细胞）的实验中尤为有益。另一项值得关注的应用包括在感染后第7天对从BILs中分离的总RNA进行实时RT-PCR分析，以鉴定效应功能。 ³例如，我们检测了感染TMEV后第7天从穿孔素功能正常和穿孔素缺陷动物中分离的脑浸润淋巴细胞（BILs）中GAPDH、颗粒酶B和穿孔素的RNA水平。我们还利用BIL...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
TMEV	Howe 实验室	N/A
Daniel’s 菌株	Invitrogen	21063-029
异氟烷	Novaplus	NDC 0409-3292-49
圆底 Oak Ridge 离心管	Nalge Nunc 国际公司	3118-0030
RPMI 1640	Invitrogen	11875-093
Percoll	GE 医疗集团	17-0891-02
10X PBS	罗氏集团	11666789001
Ficoll-Paque Plus	GE 医疗集团	17-1440-02
台盼蓝 0.4% (w/v)	Mediatech, Inc.	25-900-CI
15 ml 圆锥形离心管	BD 生物科学公司	352097
7 mL 玻璃 Pyrex 品牌 Tenbr–ck 组织研磨器	费舍尔科技公司	08-414-10B
40 μm 细胞筛	BD 生物科学公司	352340
50 mL 圆锥形离心管	BD 生物科学公司	352070
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A9647
叠氮化钠	Sigma-Aldrich	S8032
CMF-PBS	Mediatech, Inc.	21-040-CV
FACS 管	BD 生物科学公司	352054
胎牛血清	Sigma-Aldrich	F4135
2.4G2 杂交瘤细胞	ATCC	HB-197
Costar V 型底板	Corning	3894
Allegra X-22R 离心机或同等设备	贝克曼库尔特公司	N/A
96 孔板桶和转子	贝克曼库尔特公司	S2096
固定角转子	贝克曼库尔特公司	F0360
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	P6148
BD FACS Calibur	BD 生物科学公司	N/A
FlowJo 7.5	Tree Star, Inc.	N/A
CD45	BD 生物科学公司	557235	克隆号：30-F11
Gr1 (Ly6C/G)	BD 生物科学公司	553128	克隆号：RB6-8C5
CD11b	eBioscience	17-0112-83	克隆号：M1/70
F4/80	eBioscience	17-4801-82	克隆号：BM8