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1。肝脏灌注
- 麻醉成年雄性大鼠（在10至15周，体重150-200克），通过腹腔注射戊巴比妥钠溶液（50毫克戊巴比妥钠/公斤体重）。
- 放置在不锈钢锅的动物和70％的乙醇喷洒在其腹部和胸部。
- 做一个小切断皮肤和剥离。打开一把剪刀切腹部。
- 确认门静脉的位置，通过门静脉和松散丛下一个手术线程。
- 丛下腔静脉和肠系膜上静脉，以防止血液回流到肝脏的远端部分。用剪刀切割膜片打开胸腔，暴露心脏。
- 进入门静脉插入塑料导管（直径为2毫米），并拧紧螺纹导管周围。
- 连接导管灌注系统，这是用洗涤液（钙 + 镁2 +含EGTA，0.5毫米10毫米的HEPES和碳酸氢钠 3 4.2毫米的免费的HBSS，pH值7.2）装在37预热° C。
- 开始原位灌注10毫升/分钟的速度。同时，削减在右心房壁。继续灌注10分钟。
- 切换到胶原酶溶液灌注液[含10MM的HEPES和4.2mm的碳酸氢钠 3型为辅的HBSS我胶原酶（0.05％）和胰蛋白酶抑制剂（50微克/毫升），pH值7.5，灌注速度为10 - 20分钟10毫升/分钟，直到肝脏稍肿，并显示为浆膜下的肝结构解体的标志。
2。脑实质丰富的肝细胞分数
- 取出，仔细转移到无菌的胶原酶溶液含有25毫升的烧杯中肝脏。剪刀切碎成小块。
- 添加到由此产生的细胞悬液75毫升冷的MEM。轻柔吹打后，滤液通过细胞过滤器（100微米），去除结缔组织和未消化的组织碎片。
- 在50 XG在4 ° C（刹车关闭）1分钟，转移到50 ml锥形管和离心滤液。
- 小心弃上清。冷的MEM重悬沉淀。
- 重复2.4）的三倍。
3。肝细胞混合小学文化
- 暂停的DMEM含10％热灭活的FCS，补充到100微米β-巯基乙醇，10微克/毫升的胰岛素，100微克/ ml链霉素和100 U / ml青霉素，和种子组成的培养基中的细胞获得的2.5）五至十年的组织培养瓶（表面积:75厘米2）密度6.7 × 10 4细胞/平方厘米 （5 × 10 6细胞/烧瓶/ 12日-15毫升中等）。
- 孵育文化flasksat 37 ° C在5％的CO 2的气氛- 95％的空气。
- 更换培养基中每2至3天的时间间隔。
4。巨噬细胞的选择性分离
- 经过12天的文化，巨噬细胞增殖的细胞片上。通过互惠这些细胞悬浮培养瓶中摇晃，在80 - 30分钟每分钟120招在37 ° C。
- 转移到100毫米的非组织文化品位塑料菜培养基。游泳池从两个T75烧瓶中期到一个塑料盘。笔芯培养瓶中生长中期和回报他们的孵化器。
- 塑料菜孵育30分钟，在37 ° C在5％的CO 2的气氛- 95％的空气。巨噬细胞容易附着到非组织的文化品位，根据这个孵化过程中的塑料菜，而其他污染的细胞不。
- 吸液轻轻冲洗，用PBS塑料盘。重复此步骤三次。
- 加入1毫升的TrypLE Express解决方案，入菜，孵育10min后在37 ° C在5％的CO 2的气氛- 95％的空气。
- 加入9毫升培养基中。所附的巨噬细胞由细胞刮刀轻轻刮去。
- 转移到一个15毫升的锥形管和离心机在180 5分钟在25 ° C（刹车）XG的细胞悬液。
- 弃上清，加入1毫升培养基中。大力吹打分离成单个细胞。枚举由血球计数细胞数量。
- 分离步骤，可重复，在2至3天的间隔相同的文化，两个多星期的烧瓶。
- 孤立的巨噬细胞可在3.1中描述的生长培养基中培养。
5。代表性的成果
混合成年大鼠肝细胞的原代培养的一个例子是如图2所示。实质肝细胞失去上皮细胞的形态，文化的几天内退化或转化为成纤维样细胞。然后，大约每天6至12，相位对比明亮，vigourouly一轮巨噬细胞样细胞增殖的成纤维细胞表。培养瓶中摇晃，巨噬细胞可随时暂停的培养基，并随后转移和孵化塑料菜的结果在巨噬细胞选择性粘附（图3）。早在8天可收获巨噬细胞样细胞，并数达到12至14天的最大水平。超过10 6细胞可以从T75培养瓶中多次收获在2至3天的间隔两周以上，使每个烧瓶中的细胞总数的10 7％T75培养瓶中（图3）产量。孤立的巨噬细胞的纯度分别为95％至99％，作为评估流式细胞仪或大鼠巨噬细胞特异性抗体的免疫细胞化学法，如ED - 1（图4），ED - 3，OX - 41（图4）和Iba1 9。分离出的细胞显示了积极吞噬聚苯乙烯珠（图5），增殖反应，以重组GM - CSF与LPS刺激后，9多核巨细胞形成炎症/抗炎细胞因子的分泌，如巨噬细胞的典型特征。
图1混合原代培养大鼠肝细胞巨噬细胞样细胞的选择性分离和净化计 划。
图2原代培养大鼠肝细胞和巨噬细胞样细胞增殖。箭头表示多核巨细胞。比例尺= 100微米。从免疫学方法的杂志，Vol.360，47-55（2010）与爱思唯尔的许可9重印。
图3。选择性分离巨噬细胞样细胞的震动和附件方法。细胞悬浮培养液中摇动烧瓶，随后转移到非组织培养级塑料菜，并在37℃孵育早在10 min后，电镀，连接盘表面，仍然暂停，而其他污染的成纤维细胞巨噬细胞样细胞。用PBS冲洗后，获得高度纯化的巨噬细胞的人口。这些细胞获得了典型的巨噬细胞的形态，经过40分钟的文化，并经常观察有丝分裂细胞（箭头）。回收的手机号码，随后从不同文化时期的烧瓶变化显示。值是一个平均± SD三至五个烧瓶。实验重复3次，数据是由不同的符号表示。比例尺= 100微米。从免疫学方法的杂志，Vol.360，47-55（2010）与爱思唯尔的许可9重印。
图4。单克隆抗体对大鼠巨噬细胞巨噬细胞样细胞的免疫细胞化学染色。
图5。吞噬FITC标记的巨噬细胞样细胞微球。