本文介绍了一种从大鼠肝细胞原代培养中获取巨噬细胞的新方法。该方法利用巨噬细胞在培养过程中的增殖特性，随后通过振荡培养瓶并利用巨噬细胞对塑料培养皿的特异性贴附能力进行纯化。该技术无需复杂设备和操作技能，即可高效地获得肝脏巨噬细胞。
本文内容
摘要
摘要
库普弗细胞是肝脏特异的常驻巨噬细胞，在肝脏的生理和病理功能中发挥重要作用1-3。尽管已有大量文献详细描述了肝巨噬细胞的分离方法4-6，但这些方法大多需要精密设备（如离心淘析仪）以及较高的操作技术。本文提供一种新颖的方法，可从成年大鼠肝细胞的混合原代培养物中获得数量充足且纯度较高的肝巨噬细胞，其操作流程如图1所示。
通过两步灌流法分离肝细胞后7,8，制备主要由实质肝细胞组成的细胞悬液，并将其接种至含DMEM和10% FCS培养基的T75培养瓶中。实质肝细胞在培养数天后失去上皮细胞形态，发生退化或转化为成纤维细胞样细胞（图2）。随着培养进行，约第6天时，相位对比显微镜下呈明亮、圆形的巨噬细胞样细胞开始在成纤维细胞层上增殖（图2）。巨噬细胞样细胞的生长持续进行，至约第12天达到峰值，覆盖培养瓶表面的细胞层。通过轻轻振荡培养瓶，巨噬细胞可轻易悬浮于培养基中。随后将其转移至塑料培养皿并进行短暂孵育，可实现巨噬细胞的选择性贴壁（图3），而其他污染细胞则保持悬浮状态。经多次PBS洗涤后，收集贴壁的巨噬细胞。自同一T75培养瓶中，每隔两至三天可重复收获超过106个细胞，持续两周以上（图3）。通过流式细胞术或使用大鼠巨噬细胞特异性抗体进行免疫细胞化学分析，评估分离所得巨噬细胞纯度为95%至99%（图4）。分离的细胞表现出对聚苯乙烯微球的活跃吞噬作用（图5），对重组GM-CSF具有增殖反应，经LPS刺激后可分泌促炎/抗炎细胞因子，并可形成多核巨细胞9。
综上所述，我们提供了一种简单高效的方法，无需复杂设备和操作技术即可获得足够数量和纯度的肝巨噬细胞。该方法可能适用于其他哺乳动物物种。
方案
1. 肝脏灌注
- 通过腹腔注射戊巴比妥钠溶液（50 mg戊巴比妥钠/kg体重），对一只成年雄性Sprague-Dawley大鼠（10至15周龄，体重150–200 g）进行麻醉。
- 将动物置于不锈钢托盘中，用70%乙醇喷洒其腹部和胸部。
- 用剪刀在腹部做一小切口并剪开，然后剥去皮肤。
- 确认门静脉位置，将手术线穿过门静脉下方并轻轻结扎。
- 夹闭下腔静脉远端和肠系膜静脉，防止血液反流至肝脏。用剪刀剪开膈肌以打开胸腔，暴露心脏。
- 将一根塑料导管（直径2 mm）插入门静脉，并用缝线将导管牢固结扎。
- 将导管连接至灌注系统，该系统中已装载洗涤液（Ca2+-镁2+含 0.5 mM EGTA、10 mM HEPES 和 4.2 mM NaHCO₃ 的无钙镁 HBSS3 ；pH 7.2）预热至 37 °C.
- 开始灌注 原位 以10 ml/min的速度进行灌注。同时，在右心房壁上做一切口。继续灌注10分钟。
- 将灌注液更换为胶原酶溶液 [HBSS 含 10 mM HEPES 和 4.2 mM NaHCO₃]3 补充 I 型胶原酶（0.05%）和胰蛋白酶抑制剂（50 μg/ml）；pH 7.5]，以 10 ml/min 的流速灌注 10–20 分钟，直至肝脏轻微肿胀，并在浆膜下出现肝组织结构解体的迹象。
2. 实质性肝细胞富集细胞组分的制备
- 取出肝脏并小心转移至含有 25 ml 胶原酶溶液的无菌烧杯中，用剪刀将其剪成小块。
- 向所得细胞悬液中加入 75 ml 冷的 MEM，轻轻吹打混匀后，通过细胞筛网（100 μm）过滤，以去除结缔组织和未消化的组织碎片。
- 将滤液转移至 50 ml 锥形管中，在 4°C 下以 50 × g 离心 1 分钟（关闭刹车）。
- 小心弃去上清液，用冷的 MEM 重悬沉淀。
- 重复步骤 2.4）三次。
3. 肝细胞混合原代培养
- 将步骤 2.5) 中获得的细胞悬浮于生长培养基中，该培养基由含 10% 热灭活胎牛血清的 DMEM 组成，并添加 100 μM β-巯基乙醇、10 μg/ml 胰岛素、100 μg/ml 链霉素和 100 U/ml 青霉素；以 6.7 × 104 个细胞/cm2 的密度（每瓶 5 × 106 个细胞/12–15 ml 培养基）接种至五到十个组织培养瓶（表面积：75 cm2）中。
- 将培养瓶置于 37°C、5% CO2 和 95% 空气的气氛中培养。
- 每 2 至 3 天更换一次生长培养基。
4. 巨噬细胞的选择性分离
- 培养12天后，巨噬细胞在细胞膜上增殖。将培养瓶在37 °C条件下以每分钟80 - 120次的频率来回振荡30分钟，使这些细胞悬浮。
- 将培养基转移至100 mm非组织培养级塑料培养皿中。将两个T75培养瓶的培养基合并至一个塑料培养皿中。向原培养瓶中重新加入生长培养基，并放回培养箱中继续培养。
- 将塑料培养皿置于含5% CO2和95%空气的环境中，37 °C孵育30分钟。在此孵育条件下，巨噬细胞易于贴附于非组织培养级塑料培养皿表面，而其他污染细胞则不易贴附。
- 吸除培养基，并用PBS轻轻冲洗培养皿。重复此步骤三次。
- 向培养皿中加入1 ml TrypLE Express溶液，在含5% CO2和95%空气的环境中37 °C孵育10分钟。
- 加入9 ml生长培养基。使用细胞刮轻轻刮下贴壁的巨噬细胞。
- 将细胞悬液转移至15 ml锥形离心管中，在25°C条件下以180 × g离心5分钟（开启刹车）。
- 弃去上清液，加入1 ml生长培养基。通过剧烈吹打使细胞充分解离为单细胞悬液。使用血细胞计数板对细胞数量进行计数。
- 相同培养瓶可在间隔两至三天的情况下重复进行分离操作，持续两周以上。
- 分离获得的巨噬细胞可在3.1节所述的生长培养基中进行培养。
5. 代表性结果
图2展示了一例成年大鼠肝细胞混合原代培养的示例。在培养数天后，实质性的肝细胞失去上皮细胞形态，发生退变或转化为成纤维细胞样细胞。随后，在培养第6至12天左右，相位差显微镜下呈明亮圆形的巨噬细胞样细胞在成纤维细胞层上迅速增殖。通过轻轻摇动培养瓶，巨噬细胞可轻易悬浮于培养基中，随后转移至塑料培养皿中孵育，即可实现巨噬细胞的选择性贴壁（图3）。巨噬细胞样细胞最早可在第8天收获，细胞数量在第12至14天达到峰值。在一个T75培养瓶中，每隔2至3天可重复收获超过106个细胞，持续两周以上，单个T75培养瓶累计细胞产量可达107个（图3）。通过流式细胞术或使用针对大鼠巨噬细胞特异性抗体（如ED-1（图4）、ED-3、OX-41（图4）和Iba19）进行免疫细胞化学分析，评估所得巨噬细胞纯度为95%至99%。分离获得的细胞表现出巨噬细胞的典型特征，包括对聚苯乙烯微球的活跃吞噬作用（图5）、对重组GM-CSF的增殖反应、经LPS刺激后分泌促炎/抗炎细胞因子，以及形成多核巨细胞9。
图1. 从大鼠肝细胞混合原代培养物中选择性分离和纯化类巨噬细胞的方案示意图。
图2. 大鼠肝细胞的原代培养及类巨噬细胞的增殖。箭头指示一个多核巨细胞。比例尺 = 100 μm。经Elsevier许可，转载自《免疫学方法杂志》（Journal of Immunological Methods），第360卷，47-55页（2010年）9。
图3. 通过振荡和贴壁法选择性分离巨噬细胞样细胞。将培养瓶振荡后，细胞悬浮于培养基中，随后转移至非组织培养级塑料培养皿中，并在37 °C下孵育。接种后仅10分钟，巨噬细胞样细胞即已贴附于培养皿表面，而其他污染性的成纤维样细胞仍保持悬浮状态。经PBS洗涤后，可获得高度纯化的巨噬细胞群体。这些细胞在培养40分钟后呈现出典型的巨噬细胞形态，且常可见有丝分裂细胞（箭头所示）。图中还显示了在不同培养时间段从培养瓶中回收的细胞数量的后续变化。数据为3至5个培养瓶的平均值±标准差。实验重复三次，不同符号代表不同实验数据。比例尺=100 μm。经Elsevier许可，转载自《免疫学方法杂志》（Journal of Immunological Methods），第360卷，47-55页（2010）9。
图4. 使用抗大鼠巨噬细胞单克隆抗体对类巨噬细胞进行免疫细胞化学染色。
图5. 巨噬细胞样细胞对FITC标记微珠的吞噬作用。
讨论
本文报道了一种从成年大鼠肝细胞混合原代培养物中获取巨噬细胞的简单且高效的方法。该方法首先利用巨噬细胞在大鼠肝细胞混合培养中所表现出的新型增殖活性，随后根据这些细胞作为巨噬细胞的生物学特性对其进行分离与纯化9。在成年肝细胞混合原代培养物中增殖的巨噬细胞可能来源于污染入肝实质细胞组分中的库普弗细胞或相关细胞。这些巨噬细胞可能对混合原代培养中肝实质细胞10及其他成纤维样细胞转化所引起特定环境变化产生了响应。
总之，我们的方法无需使用复杂的设备和技术手段，即可从大鼠肝细胞原代培养物中分离出数量充足、纯度较高的巨噬细胞样细胞。此外，同一培养瓶可重复进行分离操作，持续两周以上。该方法可能适用于其他哺乳动物物种。
披露
所有动物均在国家动物卫生研究所的动物实验设施中饲养和操作，遵循该机构动物实验委员会制定的指南和规定。
致谢
本工作由日本农林水产省食品纳米技术项目的科研基金和援助基金资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 戊巴比妥钠溶液 | 协立精药 | 索米那普定注射液 | |
| 汉克’Hank's 平衡盐溶液（HBSS） | Invitrogen | 14185-052 | |
| 乙二醇四乙酸（EGTA） | Sigma-Aldrich | E-4378 | |
| 胶原酶 | 和光纯药工业株式会社 | 032-10534 | 细胞解离级 （需进行批号检查） |
| 胰蛋白酶抑制剂 | Sigma-Aldrich | T-9128 | |
| 伊格尔’最小必需培养基（MEM） | Sigma-Aldrich | M-4655 | |
| 杜尔贝科’s 修改的 Eagle’s 培养基（DMEM） | Sigma-Aldrich | D-6459 | 高葡萄糖型 |
| 胎牛血清 (FCS) | Hyclone | SH30070.03 | 56 ℃ 热灭活°30 分钟，4 °C （需进行批号检查） |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12605 | |
| 杜尔贝科’磷酸盐缓冲液（PBS） | Invitrogen | 14190 | Ca2+-镁2+ 免费 |
| β巯基–乙醇 | Sigma-Aldrich | M-7522 | 储备液：100 mM，溶于蒸馏水 |
| 胰岛素 | Sigma-Aldrich | I-5500 | 储存液：0.1N HCl 中配制的 10 mg/ml 溶液 |
| 青霉素/链霉素 | Invitrogen | 15070 | |
| 细胞滤筛 | BD Biosciences | 352360 | 筛网尺寸：100 μm |
| 组织培养瓶 | 住友电木有限公司 | MS-21250 | 表面积：75 cm²2 |
| 非组织培养用塑料培养皿 | BD Biosciences | 351005 | |
| 细胞刮刀 | 康宁 | 3010 | |
| 往复式摇床 | TAITEC | NR-1 |
参考文献
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- Heuff, G., Meyer, S., Beelen, R. H. Isolation of rat and human Kupffer cells by a modified enzymatic assay. J. Immunol. Methods. 174, 61-65 (1994).
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重印与许可
