小鼠大脑中动脉闭塞模型

摘要

我们在视频中演示了一种使用血管内单丝线栓在成年小鼠中建立大脑中动脉闭塞的方法。同时展示了如何通过2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色来评估脑梗死范围。

摘要

脑卒中是美国最常见的致命性神经系统疾病¹。大多数脑卒中（88%）由脑内血管阻塞引起（即缺血性脑卒中）²。由于大多数缺血性脑卒中（约80%）发生在大脑中动脉（MCA）供血区域³，因此已开发的许多动物脑卒中模型均集中于该动脉。大脑中动脉闭塞（MCAO）的经腔单丝模型是将手术缝线经颈外动脉插入，并沿颈内动脉（ICA）向前推进，直至其尖端阻塞大脑中动脉起始部，从而导致MCA供血区域血流中断并继发脑梗死⁴。该技术可用于模拟永久性或短暂性闭塞⁵。若在一定时间间隔后（30分钟、1小时或2小时）撤出缝线，则可实现再灌注（短暂性MCAO）；若将缝线留置原位（24小时），则适用于建立永久性MCAO模型。该技术无需开颅术——一种切除部分颅骨的神经外科手术，而开颅可能影响颅内压和温度⁶。该方法已成为在大鼠和小鼠中模拟永久性和短暂性局灶性脑缺血最常用的技术^7,8。为评估脑梗死范围，我们采用2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）对脑切片进行染色，以识别缺血脑组织⁹。在本视频中，我们将演示MCAO方法以及通过TTC染色测定梗死面积的操作过程。

方案

1. MCAO 方法

本方案已获得加州大学旧金山分校和肯特州立大学的机构动物护理与使用委员会批准，并遵守美国国立卫生研究院关于实验动物使用指南。

1. 将5-0单丝缝合线（Harvard Apparatus，Holliston，MA）剪成20 mm的节段。通过在电灼器附近加热（Braintree Scientific, Inc.，Braintree，MA）使每个节段的末端变圆。使用千分尺（Applied Image Inc.，Rochester，NY）测量末端的直径。对于体重为25-30 g的小鼠，我们使用末端直径为0.21-0.22 mm的缝合线。
2. 通过高压灭菌（至少121 °C，15 PSI，持续15分钟）对所有外科器械进行灭菌。使用70%乙醇对手术台及相关设备进行消毒。
3. 使用V-10麻醉系统（VetEquip, Inc.，Pleasanton，CA），以5%异氟烷（Aerrane，Baxter，Deerfield，IL）在30% O₂ / 70% N₂O混合气体中对8-12周龄小鼠（25-30 g）进行麻醉。诱导麻醉后，将异氟烷浓度降低并维持在1.5%。
4. 将小鼠仰卧位放置于加热垫上。插入直肠探针，并使用TR-200恒温控制系统（Fine Science Tools Inc.，Foster City，CA）监测并维持体温在36.5-37.5 °C之间。
5. 使用电动剪刀（Braintree Scientific）剃除颈部腹侧区域的毛发以暴露皮肤。使用70%乙醇对术区进行三次消毒。
6. 在体视解剖显微镜（Nikon，日本）下，在颈部做一条长约1 cm的正中切口。使用牵开器（Braintree Scientific）暴露手术视野，识别右侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA）。仔细分离动脉周围的神经和筋膜组织。
7. 进一步向远端分离ECA，并使用双极电凝器（Howard Instrument Inc.，Tuscaloosa，AL）对ECA及其甲状腺上动脉（STA）分支进行电凝。在电凝段处切断ECA和STA。
8. 在ECA残端周围松松地绑两根8-0丝线缝合线。在CCA分叉为ECA和ICA处应用血管夹（Fine Science Tools）。
9. 使用Vannas型弹簧剪刀（Fine Science Tools）在ECA残端末端做一个小切口。测量并记录末端已变圆的5-0单丝缝合线的长度。将缝合线插入切口并推进至夹闭处。将两根丝线缝合线适度收紧，以固定但不阻碍留置单丝缝合线的移动。
10. 移除分叉处的血管夹。轻柔地将单丝缝合线从ECA管腔推进至ICA，超过CCA分叉处9-10 mm，以阻塞大脑中动脉（MCA）起始部。手术持续时间约为30-45分钟。
11. 缝合颈部切口，将小鼠置于35 °C的护理箱中恢复麻醉，随后放回笼中。小鼠通常需要5-10分钟恢复意识。若需建立短暂性MCAO模型，研究人员可在一定时间后（通常为0.5-2小时）重新麻醉小鼠，并将缝合线撤回ECA残端内。
12. MCAO造模24小时后，使用5%异氟烷麻醉小鼠，并通过颈椎脱臼法实施安乐死。断头取脑，将脑组织置于冰上，使用脑切片模具（Braintree Scientific）冠状切成四个2 mm厚的切片。将脑切片在室温下用含2% 2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）（Sigma-Aldrich）的1×PBS溶液孵育20分钟，以评估梗死范围和大小。随后将脑切片在4 °C条件下用10%中性缓冲福尔马林溶液（Sigma-Aldrich）固定，直至成像。梗死面积的定量分析可参照JoVE实验方案955（https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=955）⁹中的方法进行。

2. 代表性结果

MCAO 诱导的梗死灶出现在纹状体和背外侧皮层。纹状体对缺血的敏感性高于大脑皮层。30 分钟的 MCAO 仅会导致纹状体发生梗死，而超过 1 小时的 MCAO 则会同时损伤纹状体和皮层。在永久性 MCAO 24 小时后，总梗死面积约占半球体积的 ~40±5%，术后死亡率约为 ~10%。如果在手术过程中出现大量出血、手术时间超过 90 分钟、小鼠在 15 分钟内未能从麻醉中恢复，或在死后检查中发现脑切片或 Willis 环基底部存在出血，则将小鼠排除在后续研究之外。

图1. 永久性大脑中动脉阻塞（MCAO）24小时后TTC染色脑切片的代表性图像（冠状面第1-4层）。在活体组织中，TTC通过脱氢酶的酶促反应被还原为1,3,5-三苯基四氮唑（TPF），呈现红色；而在坏死区域，由于缺乏此类酶活性，TTC保持白色。因此，梗死区域因无法将TTC转化为TPF而呈现白色，可据此识别。注意：TTC对热和光较不稳定，应尽可能避免染色切片暴露于热源和光照下。

讨论

小鼠MCAO模型常用于模拟人类的局灶性脑缺血。由于存在多种转基因和基因敲除小鼠品系，小鼠在脑卒中研究中的使用日益增多。本实验方案中有几个关键细节需要注意：

1. 手术期间以及小鼠完全从麻醉中恢复之前，必须维持其体温。体温会影响梗死范围；低温会减小梗死面积，而高温则会增大梗死范围。
2. 暴露和分离颈总动脉（CCA）与颈外动脉（ECA）时，应避免损伤邻近的迷走神经和气管，否则可能增加梗死面积并降低存活率。
3. 单丝缝合线插入位置不得超过分叉点10 mm。缝合线插入过深可能穿破大脑前动脉，导致脑出血。当缝合线推进至分叉点远端约9–10 mm时，会遇到一定阻力。若出现此情况，研究人员应停止推进缝合线，并确认插入距离。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
异氟烷	化学试剂	Baxter Internationl Inc.	95045-588
V-10 麻醉系统	设备	VetEquip	901807
TR-200 温度控制器	设备	Fine Science Tools	21060
电动剪毛器	设备	Braintree Scientific, Inc.	CLP-9931
解剖显微镜	设备	Nikon Instruments	SMZ745T
牵开器系统	设备	Braintree Scientific, Inc.	ACD-014
双极电凝器	设备	Howard Instrument	64000
丝线缝合线	材料	Harvard Apparatus	510479
单丝缝合线	材料	Harvard Apparatus	723351
血管夹	设备	Fine Science Tools	00396-01
Vannas 剪刀	设备	Fine Science Tools	15000-08
脑组织切片模具	设备	Braintree Scientific, Inc.	BS-2000C
2,3,5-三苯基氯化四氮唑	化学试剂	Sigma-Aldrich	T8877
10% 中性缓冲福尔马林	化学试剂	Sigma-Aldrich	HT5011