一种从黄热病蚊子 Aedes aegypti 收集并染色血细胞的实验方案

摘要

本文介绍了一种简化且准确的蚊虫血细胞采集与染色方法。该方法结合了灌注法的简便性与高精度注射技术的准确性，可分离获得埃及伊蚊（Aedes mosquitoes）中纯净的血细胞样本。本方法有助于开展需要了解血细胞类型及其丰度的相关研究。

摘要

蚊子是多种致病病原体的传播媒介，例如黄热病病毒、疟原虫和丝虫。目前，实验室正在研究疾病传播媒介物种先天免疫系统中抗病原体的组分，希望培育出对这些病原体具有抗性的转基因蚊子^{1, 2}。蚊子的先天免疫系统包含多道防御机制³。能够逃逸由肠上皮构成的蚊子中肠屏障的病原体⁴，会进入血淋巴，并与循环中的血细胞相遇；血细胞是重要的免疫细胞组分，可包裹并吞噬病原体^{5, 6}。研究人员尚未在蚊子中发现造血组织，现有证据表明，蚊子成虫羽化时血细胞数量即已固定，且随着蚊子老化，其数量可能逐渐减少⁷。正确采集并鉴定具有医学重要性的昆虫血细胞，是开展细胞免疫研究的关键步骤。然而，蚊子个体微小，血淋巴体积有限，这为免疫细胞的采集带来了挑战。

收集蚊虫血细胞的两种既定方法包括从切断的喙部挤出血淋巴⁸，以及体积置换法（灌注法），即向头部与胸部之间的膜状颈区（即颈膜）注入生理盐水，并从腹部远端撕裂处收集灌注出的血淋巴^{9, 10}。然而，这些方法分别存在血细胞回收率低以及可能被脂肪体细胞污染的局限性¹¹。最近，一种称为高注射/回收的方法通过使用抗凝缓冲液，提高了免疫细胞的回收率，同时减少了鳞片和内部组织的污染水平¹¹。尽管该方法改善了血细胞的收集与原代培养的维持，但如果下游目标仅为收集、固定和染色血细胞用于诊断，则该方法所涉及的多次注射和收集步骤并非必要。在此，我们展示了收集伊蚊（Aedes）血淋巴的方法，该方法结合了灌注法的简便性（以抗凝缓冲液替代生理盐水）与高注射技术的精确性，从而获得纯净的血细胞制备样品。

方案

1. 血细胞采集前的准备工作

1. 配制一种血淋巴稀释液，包含60% Schneider培养基、10%胎牛血清（FBS）和30%柠檬酸盐缓冲液（抗凝剂；98 mM NaOH、186 mM NaCl、1.7 mM EDTA、41 mM 柠檬酸，pH 4.5）¹¹。分装成1.0 mL每份，可于-20°C保存。每份仅使用一次（见材料部分）。
2. 使用玻璃蚀刻工具在玻璃载玻片（75 × 25 × 1 mm）一端刻出直径1 cm的圆圈以作准备。或者，也可购买带有两个预刻圆圈的载玻片（例如Fisher Scientific或EMS来源）。每只蚊子需要一片玻璃载玻片。
3. 制备一组玻璃毛细针（见材料部分），使用如下建议参数进行拉制（Sutter Instruments，型号P-87）：
   

   加热斜率+5

   拉力：45

   速度：75

   时间：175

   压力：580

   
   使用该拉针仪的上述建议参数，可制得总长约500 mm、针柄长约3 mm的玻璃针。也可直接购买预先拉制好的针（例如Tritech Research）。

2. 血细胞采集前显微注射仪的准备

1. 根据制造商的说明，将拉制好的针头插入显微注射仪的针头夹持器中。按照制造商的说明，用矿物油回填显微注射仪（参见材料）的管路、注射器以及拉制的玻璃针头。

3. 血细胞采集前雌蚊的准备工作

1. 吸取15只成年雌蚊，放入可与冰接触的小型实心笼状容器中。将装有蚊虫的笼子浸入足够深的冰中，确保笼子的整个高度及所有侧面均与冰接触。这将保证所有蚊虫均暴露于低温环境中。
   冷麻醉蚊虫约8分钟，或直至其完全无法活动。
2. 将一只蚊虫放置于凹面载玻片上。该载玻片将作为注射操作的平台。

4. 血细胞收集

1. 将显微注射仪设置为吸入12 μl 血淋巴稀释液至拉制的玻璃毛细针中，并在第七和第八腹节之间将溶液注入蚊虫体内。每12 μl 的总体积可注射约3只蚊虫，每次注射量为3–3.5 μl。注射过程中应使用镊子轻轻固定蚊虫。针尖应保留少量稀释液，以防止注入矿物油。注射后，蚊虫腹部应呈现“充盈”或肿胀状态。
2. 将已注射的蚊虫置于冰上一个单独的洁净容器中，使其恢复5分钟。抗凝稀释液在蚊虫体内孵育有助于使粘附于内部组织的血细胞脱落。平均每个5分钟恢复期内可注射3至5只新鲜蚊虫。
3. 恢复5分钟后，逐个使用显微剪刀剪去每只蚊虫的足、翅以及腹部末端（第八腹节处），操作应在置于冰上的恢复杯中进行。剪除足和翅可减少鳞片转移到收集载玻片上的可能性。注意：剪除足和翅时不应过于靠近胸部附着点，以免造成其他开口导致血淋巴流失。血淋巴仅应通过腹部末端所形成的开口进行收集。
4. 用70%乙醇清洗一片刻蚀标记的玻璃载玻片，并用擦镜纸擦干。将一只已完成注射并恢复的蚊虫置于载玻片上刻蚀圆圈外缘处。将显微注射仪设置为吸入12 μl 新鲜血淋巴稀释液，并将该体积液体注入蚊虫中胸侧部。注入时应输送大部分但非全部稀释液（约8–10 μl），以避免注入矿物油。针尖应保留少量稀释液。
5. 调整蚊虫位置，使其腹部切口位于1 cm 圆圈边缘。注射后，应将稀释的血淋巴收集在标记区域内。当针头从胸中部注射位点拔出后，重新用镊子夹住蚊虫两侧，轻压其腹部，促使血淋巴流入刻蚀圆圈区域。
6. 让稀释的血淋巴在载玻片上干燥约10分钟，或直至肉眼观察完全干燥为止。

5. 血细胞固定与染色

1. 使用HEMA3⁷（见材料）对每张载玻片分别进行染色：将载玻片浸入固定液中5次，每次1秒；再浸入溶液I中3次，每次1秒；最后浸入溶液II中3次，每次1秒。用去离子水冲洗载玻片背面，切勿冲洗正面。用吸水纸轻轻吸干载玻片正面、刻蚀圆圈外区域。
2. 在刻蚀中心周围滴加封片介质（例如Shur/Mount或Polymount），然后盖上盖玻片（25 × 25 mm）。轻轻按压盖玻片，使封片介质均匀扩散至整个盖玻片覆盖区域（包括含有染色组织的刻蚀圆圈）。载玻片至少干燥3小时或过夜。为获得最佳观察和成像效果，血细胞应在采集后2周内进行观察。

6. 代表性结果

固定并经HEMA3染色的血细胞样本示例，采自一种 埃及伊蚊 成年雌性个体如图1A-C所示。图1A显示一种血细胞，根据其体积小、呈球形至椭球形以及核质比高，被鉴定为原血细胞（550倍放大） ¹¹图1B显示一种血细胞，根据其球形形态和较高的胞质与细胞核比例，被归类为浆血细胞（550倍放大）。最后，图1C显示一种颗粒细胞型血细胞（550倍放大）。颗粒细胞具有更明显的颗粒性，形态和行为更倾向于变形虫状，且易于黏附在玻璃表面。依据已发表的血细胞分类与回收标准 ¹¹，我们的采集方法获得了相似数量的总血细胞，同样发现粒细胞占总血细胞的百分比最大 ¹¹ （图2）。

图1. 一例代表性雌性埃及伊蚊（Ae. aegypti）前血细胞（A）、类胞囊细胞（B）和粒细胞（C）的HEMA3固定染色光镜图像。C = 细胞质，N = 细胞核，G = 颗粒。

图2. 采用本研究的血淋巴稀释与采集方法，每只雌蚊获得的总血细胞数及颗粒细胞数（均值±标准误）。

讨论

本文所述的血细胞收集方法是在先前已发表方法的基础上改进而来，能够以更少的步骤从伊蚊（Aedes）蚊虫中分离出纯净的血细胞。尽管我们的研究重点在于表征伊蚊（Aedes）蚊虫中的血细胞群体，但我们认为，在通过初步试验确定合适的注射体积后，该技术也可应用于其他蚊虫类群。本方案采用抗凝缓冲液替代生理盐水，所获得的血细胞群体可真实反映体内（in vivo）的细胞数量。然而，我们尚未确定本方案是否适用于体外培养中分离血细胞的长期维持。

通过剪断喙器采集血淋巴的方法已被证明所获得的循环血细胞数量最少，因此本文不再进一步讨论。基于灌注的方法虽然操作简便，但因容易混入内部组织和鳞片污染物而受到批评¹¹。近年来发展出的高注射/回收方法虽可提高血细胞回收率并减少污染物含量¹¹，但涉及多次注射和收集步骤。我们的方案在获得相同水平血细胞回收率的同时降低了污染物水平，且所需注射与收集步骤更少，因而提供了一种简便而准确的血细胞纯净制备方法。首先，本方案中将去除足、翅及腹部末端的操作在一个独立于血淋巴收集容器的环境中...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂名称	公司	目录编号	备注（可选）
Schneider’s Medium	Sigma-Aldrich	S0146
胎牛血清	Sigma-Aldrich	F0643
Hema3 染色试剂盒	Fisher Scientific	123-869
玻璃毛细针（含丝硼硅酸盐）	Sutter Instrument Co.	BF100-78-10	外径 1.0 mm，内径 0.78 mm
拉针仪	Sutter Instrument Co.	Model P-87
显微注射仪	Tritech Research, Inc.	MINJ-PD
持针器	Tritech Research, Inc.	MINJ-4