一种从黄热病蚊子 Aedes aegypti 收集并染色血细胞的实验方案

摘要

本文介绍了一种简化且准确的蚊虫血细胞采集与染色方法。该方法结合了灌注法的简便性与高精度注射技术的准确性，可分离获得埃及伊蚊（Aedes mosquitoes）中纯净的血细胞样本。本方法有助于开展需要了解血细胞类型及其丰度的相关研究。

摘要

蚊子是多种致病病原体的传播媒介，例如黄热病病毒、疟原虫和丝虫。目前，实验室正在研究疾病传播媒介物种先天免疫系统中抗病原体的组分，希望培育出对这些病原体具有抗性的转基因蚊子^{1, 2}。蚊子的先天免疫系统包含多道防御机制³。能够逃逸由肠上皮构成的蚊子中肠屏障的病原体⁴，会进入血淋巴，并与循环中的血细胞相遇；血细胞是重要的免疫细胞组分，可包裹并吞噬病原体^{5, 6}。研究人员尚未在蚊子中发现造血组织，现有证据表明，蚊子成虫羽化时血细胞数量即已固定，且随着蚊子老化，其数量可能逐渐减少⁷。正确采集并鉴定具有医学重要性的昆虫血细胞，是开展细胞免疫研究的关键步骤。然而，蚊子个体微小，血淋巴体积有限，这为免疫细胞的采集带来了挑战。

收集蚊虫血细胞的两种既定方法包括从切断的喙部挤出血淋巴⁸，以及体积置换法（灌注法），即向头部与胸部之间的膜状颈区（即颈膜）注入生理盐水，并从腹部远端撕裂处收集灌注出的血淋巴^{9, 10}。然而，这些方法分别存在血细胞回收率低以及可能被脂肪体细胞污染的局限性¹¹。最近，一种称为高注射/回收的方法通过使用抗凝缓冲液，提高了免疫细胞的回收率，同时减少了鳞片和内部组织的污染水平¹¹。尽管该方法改善了血细胞的收集与原代培养的维持，但如果下游目标仅为收集、固定和染色血细胞用于诊断，则该方法所涉及的多次注射和收集步骤并非必要。在此，我们展示了收集伊蚊（Aedes）血淋巴的方法，该方法结合了灌注法的简便性（以抗凝缓冲液替代生理盐水）与高注射技术的精确性，从而获得纯净的血细胞制备样品。

方案

1. 血细胞采集前的准备工作

1. 制备一种血淋巴稀释液，包含60% Schneider's Medium、10%胎牛血清（FBS）和30%柠檬酸盐缓冲液（抗凝剂；98 mM NaOH、186 mM NaCl、1.7 mM EDTA、41 mM 柠檬酸，pH 4.5）¹¹。分装成1.0 mL每份，可于-20°C保存。每份仅使用一次（见材料部分）。
2. 使用玻璃蚀刻工具在玻璃载玻片（75 × 25 × 1 mm）一端刻出直径1 cm的圆圈以进行准备。或者，也可购买预先蚀刻有两个圆圈的显微镜载玻片（例如 Fisher Scientific 或 EMS 供应商）。每只蚊子需要一片玻璃载玻片。
3. 制备一组玻璃毛细针（见材料部分），使用如下建议参数进行拉制（Sutter Instruments，型号P-87）：
   

   加热斜坡 +5

   拉力：45

   速度：75

   时间：175

   压力：580

   
   使用该拉针仪的建议参数，可制得总长约500 mm、针柄长约3 mm的玻璃针。也可直接购买预先拉制好的针（例如 Tritech Research）。

2. 血细胞采集前显微注射仪的准备

1. 根据制造商说明，将拉制好的玻璃针插入显微注射仪的针头夹持器中。根据制造商说明，用矿物油反向填充显微注射仪（参见材料）的管路、注射器以及拉制好的玻璃针。

3. 血细胞采集前雌蚊的准备工作

1. 吸取15只成年雌蚊至可与冰接触的小型实心笼形容器中。将装有蚊虫的笼子浸入足够深度的冰中，使笼子的整个高度及所有侧面均与冰接触。这将确保所有蚊虫均暴露于低温环境中。
   将蚊虫冷麻醉约8分钟，或直至其不再活动。
2. 将一只蚊虫置于凹面载玻片上。该载玻片将作为注射操作的场所。

4. 血细胞收集

1. 将显微注射仪设置为吸入12 μl 血淋巴稀释液至拉制的玻璃毛细针中，并将溶液注射到蚊子第七和第八腹节之间。每12 μl 的总体积可为约3只蚊子注射，每次注射量约为3–3.5 μl。注射过程中应使用镊子轻轻固定蚊子。针尖应保留少量稀释液，以防止注入矿物油。注射后，蚊子腹部应呈现“充盈”或肿胀状态。
2. 将注射后的蚊子放入置于冰上的独立洁净容器中，使其恢复5分钟。抗凝稀释液在蚊子体内孵育有助于使粘附于内部组织的血细胞脱落。平均每个5分钟恢复周期内可注射3至5只新鲜蚊子。
3. 恢复5分钟后，使用显微剪刀逐个在冰上放置的回收杯中剪去每只蚊子的足、翅以及腹部末端（第八腹节处）。剪除足和翅可减少鳞片转移到收集载片上的可能性。注意：不要将足和翅剪得过于靠近胸部连接处，以免造成其他血淋巴泄漏的开口。血淋巴应仅通过腹部末端形成的开口收集。
4. 用70%乙醇清洗一张刻蚀玻璃载片，并用擦镜纸擦干。将一只已注射并恢复的蚊子置于载片刻蚀圆圈外缘处。将显微注射仪设置为吸入12 μl 新鲜血淋巴稀释液，并将此体积的稀释液注射至蚊子中胸侧面。注入大部分但非全部稀释液体积（约8–10 μl），以避免注入矿物游戏副本。针尖应保留少量稀释液。
5. 调整蚊子位置，使其腹部切口位于1 cm 圆圈边缘处。注射后，应将稀释的血淋巴收集在标记区域内。从中胸注射位点拔出针头后，继续用镊子夹住蚊子，并用镊子轻轻挤压腹部，使血淋巴流入刻蚀圆圈区域。
6. 让稀释的血淋巴在载片上干燥约10分钟，或直至肉眼观察完全干燥为止。

5. 血细胞固定与染色

1. 使用HEMA3⁷（见材料）对每张玻片分别进行染色：将玻片浸入固定液中5次，每次1秒；再浸入溶液I中3次，每次1秒；最后浸入溶液II中3次，每次1秒。用去离子水冲洗玻片背面，玻片正面不得冲洗。用吸水纸轻轻吸干玻片正面刻蚀区域外的液体。
2. 在刻蚀中心周围滴加封片介质（例如Shur/Mount或Polymount），然后盖上盖玻片（25 × 25 mm）。轻轻按压盖玻片，使封片介质扩散至盖玻片覆盖的整个区域（包括含有染色组织的刻蚀区域）。将玻片静置干燥至少3小时或过夜。为获得最佳观察和成像效果，血细胞应在采集后2周内进行观察。

6. 典型结果

固定并经HEMA3染色的血细胞示例，采自于一个 埃及伊蚊 成年雌性个体如图1A-C所示。图1A显示一种血细胞，根据其体积小、呈球形至椭球形以及核质比高，我们将其鉴定为原血细胞（550倍放大） ¹¹图1B显示一个血细胞，根据其球形形态和较高的胞质与核比例，被归类为类浆细胞（550倍放大）。最后，图1C显示一个颗粒细胞型血细胞（550倍放大）。颗粒细胞具有更明显的颗粒性，形态和行为更倾向于变形虫状，并能在玻璃表面附着。依据先前发表的血细胞分类与回收标准 ¹¹，我们的采集方法获得了相似数量的总血细胞，同样发现粒细胞占总血细胞的百分比最大 ¹¹ （图 2）。

图1. 伊蚊（Ae. aegypti）成年雌蚊的代表性原血细胞（A）、类卵细胞（B）和粒细胞（C）的HEMA3固定染色光镜图像。C = 细胞质，N = 细胞核，G = 颗粒。

图 2. 通过我们的血淋巴稀释与采集方法获得的每只雌蚊总血细胞与粒细胞数量及其标准误（± SE）。

讨论

本文所述的血细胞收集方法是在先前已发表方法的基础上改进而来，能够以更少的步骤从伊蚊（Aedes）蚊虫中分离出纯净的血细胞。尽管我们的研究重点在于表征伊蚊（Aedes）蚊虫中的血细胞群体，但我们认为，在通过初步试验确定合适的注射体积后，该技术也可应用于其他蚊虫类群。本方案采用抗凝缓冲液替代生理盐水，所获得的血细胞群体可真实反映体内（in vivo）的细胞数量。然而，我们尚未确定本方案是否适用于体外培养中分离血细胞的长期维持。

通过剪断喙器采集血淋巴的方法已被证明所获得的循环血细胞数量最少，因此本文不再进一步讨论。基于灌注的方法虽然操作简便，但因容易混入内部组织和鳞片污染物而受到批评¹¹。近年来发展出的高注射/回收方法虽可提高血细胞回收率并减少污染物含量¹¹，但涉及多次注射和收集步骤。我们的方案在获得相同水平血细胞回收率的同时降低了污染物水平，且所需注射与收集步骤更少，因而提供了一种简便而准确的血细胞纯净制备方法。首先，本方案中将去除足、翅及腹部末端的操作在一个独立于血淋巴收集容器的环境中...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂名称	公司	目录编号	备注（可选）
Schneider’s Medium	Sigma-Aldrich	S0146
胎牛血清	Sigma-Aldrich	F0643
Hema3 染色试剂盒	Fisher Scientific	123-869
玻璃毛细针（含丝硼硅酸盐）	Sutter Instrument Co.	BF100-78-10	外径 1.0 mm，内径 0.78 mm
拉针仪	Sutter Instrument Co.	Model P-87
显微注射仪	Tritech Research, Inc.	MINJ-PD
持针器	Tritech Research, Inc.	MINJ-4