采用微阵列分析来确定秀丽隐杆线虫（C. elegans）的基因表达谱，并利用实时PCR对微阵列数据进行验证和定量。
本文内容
摘要
摘要
突触由信号细胞中的突触前活性区和靶细胞中的突触后终末组成。在化学突触中，信息通过从突触前终末释放的神经递质传递，并由突触后细胞上的受体接收。我们先前在Caenorhabditis elegans中的研究表明，VSM-1负调控胞吐作用。此外，对vsm-1突变体中突触的分析显示，缺乏完全功能性VSM-1的动物其突触连接性增加。基于这些初步发现，我们假设C. elegans中的VSM-1可能在突触形成过程中发挥关键作用。为验证这一假设，我们进行了双标记微阵列分析，并确定了基因表达谱。首先，提取总RNA，逆转录为cDNA，然后与DNA微阵列杂交。随后，对荧光探针杂交结果进行计算机分析，发现突触形成增强的突变体中，编码主要精子蛋白家族（MSP）成员的多个基因显著上调。MSP是C. elegans精子的主要成分，似乎可促进线虫卵母细胞的成熟和排卵。在果蝇中，Chai及其同事1证明MSP样分子可调控神经肌肉接头处突触前小结的数量和大小。此外，Tsuda及其合作者2的研究表明，MSP可能作为Eph受体的配体，触发受体酪氨酸激酶信号级联反应。最后，实时PCR分析证实，在vsm-1(ok1468)突变体中编码MSP-32的基因表达上调。综上所述，我们实验室的研究表明，vsm-1突变体的突触密度显著增加，这一现象可能由MSP-32信号通路介导。
方案
1. 总RNA的提取
- 通过用室温M9培养基冲洗培养板收获健康且同步化的线虫，每板使用2-3 ml。将重悬的线虫转移至15 ml锥形管中，在4°C下以3200 g离心4分钟进行沉淀。通过向沉淀中加入7 ml 0.1 M NaCl和7 ml冰上预冷的60% w/v蔗糖溶液，去除漂浮的细菌。将重悬混合物在冰上孵育15分钟，清洁的线虫会游离至蔗糖溶液上层，随后在4°C下以3200 g离心4分钟收集上清中的线虫。使用无菌移液器将无菌的线虫转移至新的锥形管中，并用最多15 ml无RNase水洗涤两次，每次洗涤后在4°C下以3200 g离心2分钟。将清洁且松散聚集的沉淀转移至1.5 ml微量离心管中，在最大转速（约10,000 g）下离心30秒。最后，吸除大部分无RNase水，向沉淀中加入10倍体积的RNAlater，4°C保存直至后续操作。
- 为制备总RNA样品，将收获的线虫在最大转速（约10,000 g）下离心4分钟，弃去RNAlater。然后向沉淀中加入少量分子研磨树脂（G bioscience），并用液氮冷冻。使用研钵将冷冻的线虫悬浮液研磨成细粉，必要时添加液氮以保持样品低温。研磨完成后，将提取物置于冰上静置5分钟，随后加入700 μl RLT/BME（RLT与BME体积比为100:1）（Qiagen）和472 μl 100%乙醇，混匀。
- 使用RNeasy Mini Kit（Qiagen）按照制造商推荐的操作流程分离总RNA。每个生物学样本最终获得的RNA体积为60 μl。
2. DNA 消化与 RNA 纯化
- 使用 DNase I（Qiagen）消化可能含有基因组 DNA 污染的 50 μg 总 RNA。消化反应体系包含 0.1 U DNase/1 μg RNA 和 1X Buffer RDP，在室温下孵育 10 分钟。
- 经 DNase I 处理的 RNA 样品使用 RNeasy MinElute Clean-Up Kit（Qiagen）进行纯化。按照制造商推荐的方案操作，最终获得 60 μl 洗脱体积。
3. RNA 的定性与定量分析
- 使用紫外分光光度计Nanodrop（Thermo Scientific）测定RNA浓度。
- 采用琼脂糖电泳评估RNA样品的完整性。简言之，使用1X Northern Max Gly Gel Prep/Running Buffer（Ambion）、1%无RNase的低电渗琼脂糖（Ambion）和0.5 μg/ml溴化乙锭制备1%无RNase琼脂糖凝胶。在凝胶聚合的同时，向每个RNA样品中加入5 μl乙二醛上样染料，混匀后于50°C孵育30分钟以实现RNA的乙二醛化修饰。同时对RNA分子量标记物进行乙二醛化处理，并上样以用于片段大小比对。
4. cDNA 合成
- 每项合成反应中，将 8.4 μg RNA 样本与 1 μl RT 引物（1 pmole/μl）混合。其中一个样本（野生型或突变型）加入 Cy5 捕获 RT 引物，另一个样本加入 Cy3 捕获 RT 引物（随 Genisphere 的 Array 350 标记-检测试剂盒提供）。样本混合物在 75–80°C 加热 10 分钟，随后转移至冰上冷却 2–3 分钟。
- 在 RNA 样本孵育的同时，按如下方法配制 MasterMix（Genisphere）：每项 RT 反应中，混合 4 μl 5X RT 反应缓冲液、1 μl dNTP（每种 dATP、dCTP、dGTP、dTTP 浓度为 10 mM）、1 μl Superase-In RNase 抑制剂（随 Genisphere 的 Array 350 标记-检测试剂盒提供）和 1 μl RT 酶（200 u/μl）。最后，向每个 RNA 样本中加入 7 μl MasterMix，轻轻混匀（禁止使用涡旋振荡器），并在 42°C 孵育 2 小时。
5. RNA 降解与 cDNA 样本的纯化
- 通过加入 3.5 μl 0.5M NaOH/50mM EDTA（终浓度）终止 cDNA 合成，并在 65°C 下孵育 15 分钟。随后使用 1M Tris-HCl（pH 8.0）中和反应体系，使 Tris-HCl 的终浓度达到 850 mM。最后，将野生型（WT）和突变型 cDNA 混合至同一微量离心管中。用 73 μl 1X TE 缓冲液冲洗空管，并将冲洗液加入含 cDNA 的管中；混合后 cDNA 溶液的最终体积为 130 μl。
- 混合后的 cDNA 按照 QIAquick PCR Purification Kit（Qiagen）的制造商说明书进行纯化。纯化后洗脱的 cDNA 体积为 60 μl。
6. 第一次微阵列杂交
- 通过GCAT（Genome Consortium for Active Teaching）获得的 C. elegans 微阵列芯片在室温下用含有0.1 mg/ml超声处理的鲑鱼精子DNA的3X SSC、0.1% SDS溶液封闭1小时。封闭后的芯片通过浸入ddH2O中进行漂洗，并在50 ml锥形管中以2,000 g离心1分钟进行甩干，管底放置KimWipe吸水纸。
- 随后，将2X甲酰胺杂交缓冲液（Genisphere）在55°C孵育10分钟，充分混匀以溶解结晶，并在10,000 g离心1分钟。接着，将25 μl cDNA样品与25 μl 2X甲酰胺杂交缓冲液通过轻弹管壁的方式温和混匀。混匀后的稀释cDNA样品通过瞬时离心15秒收集，并在80°C孵育10分钟。
- 最后，通过移液器小心地将全部加热后的cDNA样品加至微阵列芯片表面，避免触碰芯片。使用注射器针头轻轻放下盖玻片，使样品在微阵列上均匀铺展。在盖玻片完全放下前，先将其略微提起，再用针头再次缓慢放下，使其自然就位，以尽量减少气泡产生。第一次杂交的设置完成于将芯片水平放置在50 ml锥形管中，芯片下方放置50 μl ddH2O，并在37°C过夜孵育。
7. 第二次杂交
- 将杂交后的微阵列在不同温度下用2X SSC进行洗涤。首先，将微阵列玻片转移至含有室温2X SSC和0.2% SDS的锥形管中，轻轻晃动以去除盖玻片。随后，将微阵列玻片转移至含有55°C 2X SSC和0.2% SDS的锥形管中，在55°C下孵育15分钟。接着，将玻片转移至2X SSC溶液中，在室温下孵育15分钟，并定期轻轻振荡。最后，将玻片转移至0.2X SSC溶液中，在室温下孵育15分钟，并定期轻轻振荡。洗涤后的玻片通过离心干燥：将标签面朝下的玻片放入底部垫有KimWipe的50 ml锥形管中，于2,000 g离心1分钟。
- 接下来，使用基于2X甲酰胺的杂交缓冲液（Genisphere）制备第二次杂交混合液。将杂交缓冲液在55°C孵育10分钟，并在10,000 g离心1分钟。捕获荧光试剂（Cy3和Cy5）及抗淬灭试剂在室温下解冻，并用铝箔包裹以避免光漂白。后续杂交步骤均在避光条件下进行，以尽量减少光照暴露。将150 μl 2X甲酰胺杂交缓冲液与1.5 μl抗淬灭试剂混合，制备含抗淬灭剂的杂交混合液。
- 将Cy3和Cy5捕获试剂涡旋振荡3秒，并在10,000 g离心15秒。将第二次杂交混合液配制如下：75 μl含抗淬灭剂的杂交混合液、60 μl无核酸酶水、7.5 μl Cy3捕获试剂和7.5 μl Cy5捕获试剂。将第二次杂交混合液在75°C孵育10分钟，然后小心地用移液器吸取50 μl加热后的混合液滴加到已洗涤并干燥的微阵列玻片上。为使样品均匀分布在微阵列表面，使用注射器针头轻轻放下盖玻片。在盖玻片尚未完全放下的时候，将其稍微拉起，再用针头重新放下，使其缓慢自然贴合，以尽量减少气泡产生。将正在杂交的微阵列玻片水平放置于包裹铝箔的50 ml锥形管中，并在玻片下方加入50 μl ddH2O，以形成湿润环境。第二次杂交在37°C下孵育2–5小时。
- 在避光条件下，用室温的2X SSC、0.2% SDS和1 mM DTT溶液洗涤第二次杂交后的微阵列，并轻轻晃动以去除盖玻片。然后，将微阵列转移至含有55°C 2X SSC、0.2% SDS和1 mM DTT的带盖锥形管中，在55°C下孵育15分钟。接着，将玻片转移至含有2X SSC和1 mM DTT的带盖锥形管中，在室温下孵育15分钟，并定期轻轻振荡。最后，将玻片转移至0.2X SSC和1 mM DTT溶液中，在室温下孵育15分钟，并定期轻轻振荡。通过离心干燥微阵列玻片：将标签面朝下的玻片放入底部垫有KimWipe的带盖50 ml锥形管中，在2,000 g下离心1分钟。干燥后的微阵列玻片使用位于戴维森学院的GenePix Personal Scanner model 4100A进行扫描。
8. 微阵列分析
- 使用由戴维森学院 Laurie Heyer 及其本科学生开发的 MAGICTool 软件分析扫描后获得的图像。简要步骤如下：在“项目”选项卡下创建并保存一个“新项目”；在“构建表达谱”选项卡下选择“加载图像对”，将红色图像文件（_635.tif）作为“红色”上传，绿色图像文件（_532.tif）作为“绿色”上传；然后，在“构建表达谱”选项卡下使用“加载基因列表”功能，上传一个 秀丽隐杆线虫 从GCAT网站获得的基因列表文件已上传。
- 使用“构建表达谱”选项卡中的“创建/编辑网格”功能对微阵列图像进行定位和网格化。在“网格设置”对话框中，将网格数量设置为“48”，每个网格的行列数设置为“22行”和“22列”，点阵编号方式设为“从左到右”和“从上到下”。通过增加“对比度百分比变化”并放大网格，直至各个点阵清晰可辨。首先在左侧面板选择“设置左上角点阵”，然后依次点击“网格1”中左上角点阵中心、右上角点阵中心以及最底行的中心位置，完成网格创建。上述网格化操作按从左至右、从上至下的顺序对全部48个网格逐一重复进行。完成网格化后，通过“文件”菜单中的“将当前网格另存为”保存当前网格。成功保存网格后，选择“完成”选项卡。
- 为消除分析中无关的斑点，在“构建表达谱”选项卡中选择“寻址网格”下的“斑点标记”功能。对拖尾斑点或背景荧光进行标记后，通过“文件”选项卡中的“将当前标记另存为”进行保存。
- 使用“构建表达谱”选项卡对已标记的文件进行分割，并选择“固定半径”作为分割方法。将半径设置为所需大小，然后点击“更新数据”。为确保圆形区域始终位于网格区域内（黄色方框），自上而下、从左到右逐一滚动检查，确认无误后选择“创建表达谱”。
- 在分割过程中，软件计算了标记后剩余每个点的红/绿荧光比值。通过“表达”选项卡，选择“操作数据”中的“转换”功能，弹出“数据转换”对话框，在其中选择“logb(x)”选项，并输入 b=2。随后从“表达”选项卡中浏览“工作表达文件”。在一项实验中，野生型使用 Cy3（绿色）捕获序列，突变体使用 Cy5（红色）捕获序列，则经对数转换后的比值为正值表示基因被诱导表达，负值表示基因被抑制表达。
- 最后，在“表达”选项卡下选择“探索”，以分析由特定因子诱导或抑制的基因。在“探索”对话框中，将“查找符合以下条件的基因”设置为“最大值” > X（基因诱导的正值）”或“最小值 < X（基因被抑制时为负数）在如第5步所述的实验中。倍数表达量等于2的x次方，其中‘x’为在筛选标准中输入的数值。
9. cDNA 合成与实时 PCR
- 总RNA的提取方法如前所述。在确定所提取RNA的质量和浓度后，使用iScript cDNA合成试剂盒（BioRad）、500 ng/μl的野生型和突变型总RNA，以及制造商推荐的操作流程合成cDNA。
- 实时PCR反应体系包含iQ SYBR Green Supermix（BioRad）、100–500 nmol的基因特异性引物（表1）以及上一步生成的4 μl cDNA。使用CFX96实时系统（BioRad）运行10 μl反应体系。
- 首先将热循环仪加热至95°C，持续3分钟；随后进行95°C变性5秒、58°C退火30秒的循环步骤，共循环40次，并插入65–95°C熔解曲线分析，升温梯度为0.5°C。采用三个看家基因（act-1、cdc-42和pmp-3）作为内参，计算ΔΔCT值。
| 基因 | 正向引物 | 反向引物 |
| gst-5 | CTGCTCCATTCGGACAACTT | TCCGTTGAGCTTGAACTCAC |
| gst-9 | GGAAGACAACTGGCACAATC | ACCGAGAGCATCAACTTGAG |
| kcnl-1 | TACGCTCGGCATGTGTTGTATC | CCAATCATCGGCTCCACTATCT |
| ksr-2 | CGAACTGCTGCTGGAATGCT | GTGCTGCGTCTCTTCTGCTT |
| lim-9 | CTCATCGAGTGGCTCAATCT | CACCTTGCTCCATCTTCAAC |
| lpr-6 | CAGCAGTCACTTCTGTTCAC | TCTCCAATAGCGGTACTCC |
| mes-6 | TTGTTCCGTTGGCTCACGTACAG | CGACAGACGCAGATACACGATCA |
| msp-32 | GCCGCACAGGTATGATCCAG | ATCCAATACGGCGAGCCGAG |
| msp-142 | GATCCACCATGTGGAGTTCT | GATTCTTGCGACGGACCATA |
| msp-38 | GCCTTCGGACAAGAGGATACC | CCATACCGTCTCCTTGGAACC |
| msp-45 | TCACCGTTGAGTGGACCAAT | ACGAACCAACCGTCTCCTT |
| msp-49 | CGACGACAAGCACACCTACCACATCAA | TCGAGGACTCCACATGGTGGATCAACT |
| msp-56 | CGAAGATCGTCTTCAATGCGCCATAC | TCCACATGGTGGATCAACTCCAAGTC |
表1. 实时PCR的正向与反向引物序列
10. 代表性结果：
RNA 提取与分析
活性区前体囊泡在突触前位点的融合是突触形成过程中的必要步骤（3）。VSM-1 是一种最近发现的v-SNARE主调控蛋白，据推测可通过一种尚未明确的机制抑制酵母中的囊泡融合以及线虫中的突触形成（见图1）（4，以及我们未发表的工作）。为了更深入地理解VSM-1在线虫中调控的分子通路，并为突触形成领域提供新的见解，我们开展了全基因组筛选，发现在线虫缺乏完全功能性的VSM-1时，主要精子蛋白基因（msp）被诱导表达。
为了研究 C. elegans 的 vsm-1 (ok1468) 突变株中被诱导表达的基因，我们进行了微阵列基因分析。该分析通过检测从野生型和 vsm-1 突变株中分离的转录本并确定其富集程度来完成。具体而言，我们首先从同步化的 L4 和 L3 期野生型及 vsm-1 突变型线虫幼虫中提取总 RNA。随后，使用 DNase I 处理所获得的总 RNA，并通过琼脂糖凝胶电泳检测提取 RNA 的质量。在图 2 所示的实验中，第一泳道使用了 DNA 标准分子量标记，以表示各标准片段的碱基对数目。野生型样本在经 DNase I 处理前和处理后的样品分别加样于第 2 和第 4 泳道，而 vsm-1 突变型样本在处理前和处理后的样品则分别加样于第 3 和第 5 泳道。RNA 凝胶电泳分析结果显示，野生型和 vsm-1 突变型的 RNA 样品完整且质量良好，这一判断依据是观察到了代表核糖体 RNA 两个亚基的两条清晰条带。
微阵列杂交
在确定RNA质量后，我们开始进行cDNA合成。为此，我们对mRNA进行逆转录，并在末端添加捕获序列。将含有Cy3和Cy5捕获序列的cDNA产物与微阵列芯片杂交，随后送样进行扫描。微阵列图像被导入由戴维森学院Laurie Heyer及其本科学生开发的开源计算机软件MAGICTool中。利用该软件，我们叠加了Cy3和Cy5图像，对微阵列进行网格化处理，并分析了荧光信号谱型（见图3）。完成网格划分后，我们对每个独立方格进行分割，确保完整检测到所打印的寡核苷酸。随后分析诱导倍数，并生成基因表达谱，结果显示在突触生成增强的线虫中，编码MSP家族的基因被诱导表达。（表3）。
使用实时 PCR 验证和定量基因表达。
为了进一步了解vsm-1突变体的遗传特征，我们利用实时PCR分析了多个编码MSP家族成员的基因。首先，从野生型和vsm-1(ok1468)突变株中提取总RNA。随后将RNA样本逆转录为cDNA，并用于实时PCR分析。实时PCR表达谱的评估结果显示，MSP家族中的一个成员在vsm-1(ok1468)突变体中似乎被诱导表达。此外，实时PCR数据验证了微阵列实验的结果，并将候选基因范围缩小至一个msp基因（图4）。
图1. A. UNC-17免疫染色显示，vsm-1突变体在背神经索区域具有更高的突触密度。图像在63倍放大倍数下分析，位置位于阴门后方（右侧）。B. 对野生型和vsm-1（ok1468）突变体突触的分析表明，vsm-1突变体的突触密度显著增加（**p<0.01）。每种基因型均采集了20条线虫的图像。
图2. 使用琼脂糖凝胶电泳检测提取RNA的质量。在野生型和vsm-1(ok1468)样品提取的RNA中，DNase I处理前后均可观察到两个完整的核糖体亚基。
图3. A. 一项实验的基因芯片图像，其中对照样本用红色（Cy5）标记，vsm-1 突变体用绿色（Cy3）标记。B. 每张基因芯片分析的48个网格中的一个代表性图像。每个网格上的每个小方格代表一个打印的寡核苷酸，每个网格由22行和22列组成。
表 2. 对从幼虫4期（A）和幼虫3期（B）C. elegans 线虫中分离的转录本进行的微阵列分析显示，编码主要精子蛋白的基因在突触生成增强的突变体中被诱导表达。高亮显示的基因为在幼虫3期和幼虫4期中均被诱导的基因。
图4. 实时荧光定量PCR分析表明，msp基因家族中的一个成员， msp-32 被诱导产生 vsm-1(ok1468) 突变体。代表性归一化倍数表达量图显示 vms-1 (ok1468) ΔΔCT 值用于 msp-32 与野生型（WT）相比存在显著差异，且使用三个看家基因（act-1、cdc-42 和 pmp-3）进行标准化。三个重复样本的平均值以均值 ± 标准差表示。
讨论
在本研究中，我们开发了一种简便且用户友好的实验方案，可用于确定各种生物学现象背后的基因表达谱。该方案首先分离总RNA，并用DNase I进行处理。我们的RNA提取方法通过省略苯酚抽提步骤并采用亲和树脂纯化，已得到显著简化5,6。简言之，通过液氮冷冻线虫并用分子树脂研磨，使C. elegans的角质层和细胞膜破裂。随后，在cDNA合成前，将提取的RNA用DNase I处理。此步骤的加入旨在最大限度减少非特异性杂交；若RNA样品被基因组DNA污染，可能引入干扰并产生大量假阳性结果。接着，将野生型和vsm-1(ok1468)突变体的cDNA分别标记Cy3和Cy5捕获序列，并杂交至通过GCAT项目获得的C. elegans微阵列芯片上。该系统比类似产品更灵敏，其双色设计减少了所需芯片数量，从而提高了时间和成本效率7,8。此外，该系统无需其他类似系统所需的专用设备，因此可在任何标准实验室环境中完成7。第三步，使用开源软件MAGICTool分析荧光杂交芯片图像，并生成基因表达谱。MAGICTool是一款用户友好的程序，适用于从本科生到博士后各级经验水平的研究人员。然而，其最佳性能需要较大的内存支持。最后，通过实时PCR验证微阵列分析获得的候选基因。
尽管基因组学方法是研究生物学现象的有效手段，但仍有一些局限性需要考虑。首先，尽管本微阵列实验方案具有特异性，但如果所使用的寡核苷酸探针来自保守序列，则同一基因家族内的转录本彼此之间无法区分。实时PCR可弥补基因家族内部序列相似性带来的问题，甚至能够区分同一基因的不同异构体。然而，实时PCR面临的一个挑战是难以找到在整个生物体生命周期中表达水平恒定的真正对照基因，因此其结果只能是相对定量。蛋白质组学方法是本技术的一种替代方案，可通过二维凝胶电泳分离单个蛋白质，并利用质谱技术进行鉴定。
我们的研究明确表明，在突触密度增加的 vsm-1 突变型线虫中，主要精子蛋白（Major Sperm Protein, MSP）家族的多个成员被诱导表达。MSP 是 C. elegans 特有的蛋白，负责卵母细胞成熟和排卵过程。Chai 1 的研究证明，在果蝇神经肌肉接头处，突触前小体的数量和大小可能由含有主要精子蛋白结构域的分子调控。Tsuda 及其同事的研究 2 表明，主要精子蛋白结构域可能作为Ephrin受体的配体，触发受体酪氨酸激酶信号级联反应。此外，实时PCR分析验证并缩小了微阵列结果的范围，最终聚焦于 msp 家族中的一个成员——msp-32。综上所述，本文所呈现的工作不仅对神经科学领域的一个核心难题进行了全基因组水平的分析，也彰显了本科生科研在科学探索中的重要作用。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作由位于俄克拉荷马州韦瑟福德的南俄克拉荷马州立大学的本科学生完成。本研究得到美国国家科学基金会RUI-0963258项目、美国国立卫生研究院俄克拉荷马州INBRE项目2P20RR016478、GCAT以及OCAST HR09-137S项目的资助。
vsm1(ok1468) 突变体由俄克拉荷马基因敲除联盟分离获得。
作者感谢 Dan Stefanovic 和 Tanner Wheeler 在项目执行过程中提供的宝贵帮助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| RNA Later | Ambion | AM7020 | |
| 分子研磨树脂 | G-Biosciences | 786-138 | |
| RNeasy Mini 试剂盒 | Qiagen | 74104 | |
| 无RNase琼脂糖LE | Ambion | AM9040 | |
| NorthernMax Gly 10X 凝胶配制/电泳缓冲液 | Ambion | 8678 | |
| RNA Millenium 标记物 | Ambion | AM7150 | |
| 乙二醛上样染料 | Ambion | 8551 | |
| DNase 试剂盒 | Qiagen | 79254 | |
| RNeasy MinElute 试剂盒 | Qiagen | 74204 | |
| 逆转录酶及5X反应缓冲液 | Genisphere | RT300320 | |
| Array 350 | Genisphere | W300180 | |
| QIAquick PCR 纯化试剂盒 | Qiagen | 28104 | |
| 20X SSC | VWR international | 82021-4846 | |
| 剪切鲑精DNA | Ambion | AM9680 | |
| SDS溶液 | Promega Corp. | V6551 | |
| DTT EM | VWR international | 3860 | |
| iScript cDNA 合成试剂盒 | Bio-Rad | 170-8890 | |
| iQ SYBR Green 超级混合液 | Bio-Rad | 170-8880 |
参考文献
- Chai, A., Withers, J., Koh, Y. H., Parry, K., Bao, H., Zhang, B., Budnik, V., Pennetta, G. hVAPB, the causative gene of a heterogeneous group of motor neuron diseases in humans, is functionally interchangeable with its Drosophila homologue DVAP-33A at the Neuromuscular Junction. Hum Mol Genet. 17, 266-280 (2008).
- Tsuda, H., Han, S. M., Yang, Y., Tong, C., Lin, Y. Q., Mohan, K., Haueter, C., Zoghbi, A., Harati, Y., Kwan, J., Miller, M., Bellen, H. J. The Amyotrophic Lateral Sclerosis 8 protein VAPB is cleaved, secreted, and acts as a ligand for Eph receptors. Cell. 133, 963-977 (2008).
- Dresbach, T., Torres, V., Wittenmayer, N., Altrock, W. D., Zamorano, P., Zuschratter, W., Nawrotzki, R., Ziv, N. E., Garner, C. C., Gundelfinger, E. D. Assembly of Active Zone Precursor Vesicles. Journal of Biological Chemistry. 281, 6038-6047 (2005).
- Lustgarten, V., Gerst, J. E. Yeast VSM1 Encodes a v-SNARE Binding Protein That May Act as a Negative Regulator of Constitutive Exocytosis. Molecular and Cellular Biology. 19, 4480-4494 (1999).
- Viñuela, A., Snoek, L., Riksen, J., Kammenga, J. Genome-Wide Gene Expression Analysis in Response to Organophosphorous Pesticide Chlorpyrifos and Diazinon in C. elegans. PloS one. 5, 1-8 (2010).
- Niwa, R., Hada, K., Moliyama, K., Ohniwa, R., Tan, Y., Olsson-Carter, K., Chi, W., Reinke, V., Slack, F. C. elegans sym-1 is downstream target of the hunchback-like-1 developmental timing transcription factor. Cell Cycle. 8, 4147-4154 (2009).
- Kershner, A., Kimble, J. Genome-wide analysis of mRNA targets for Caenorhabditis elegans FBF, a conserved stem cell regulator. PNAS. 107, 3963-3941 (2010).
- Hammock, E., Eagleson, K., Barlow, S., Earls, L., Miller, D., Levitt, P. Homologs of genes expressed in Caenorhabditis elegans GABAergic neurons are also found in the developing mouse forebrain. Neural Development. 5, 1-14 (2010).
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