缺血性心力衰竭的基因转导在临床前模型中的研究

摘要

本文描述了一种利用猪心肌梗死模型进行缺血性心力衰竭基因治疗的基因转移方法。我们这一简单且可重复的方法能够便捷地以一种极为简便和可重复的方式评估多种基因转移的有效性。

摘要

目前正在为心力衰竭患者开发多种新兴技术。必须进行充分的临床前评估，以确定其有效性和安全性。

利用病毒载体进行基因治疗是治疗心脏疾病最有前景的方法之一。通过更换载体基因，利用病毒递送多种不同基因具有不可估量的治疗潜力。

本视频展示了利用猪模型建立心力衰竭动物模型并进行基因转移的完整过程。首先，通过闭塞左前降支冠状动脉近端来诱导心肌梗死。心脏重构最终导致慢性心力衰竭。本模型的独特之处在于可形成相对较大的瘢痕组织，真实反映了需要积极治疗才能获得良好预后的重度心力衰竭患者情况。在心肌梗死形成并发展出瘢痕组织后，实施冠状动脉内病毒注射，同时输注硝酸甘油。我们的注射方法操作简便，基因转导效率高，并可增强基因表达。心肌梗死猪模型联合冠状动脉内病毒递送技术已被证实为一种稳定且可重复的方法学，不仅有助于评估单个基因的作用，还可用于比较多种基因作为治疗候选物的疗效。

方案

1. 心肌梗死模型的建立

1. 使用 Animal Biotech Industries（美国宾夕法尼亚州多伊尔斯敦）提供的雌性约克夏猪（20kg），以泰拉唑（替来他明/唑拉西泮）(8.0 mg/kg) 和布托啡诺（0.6 mg）进行术前给药。
2. 动物经气管插管后以100%氧气通气。整个手术过程中以丙泊酚（5–8 mg/kg/hr）维持全身麻醉。
3. 股动脉穿刺部位先用70%异丙醇消毒，再用聚维酮碘处理。经皮穿刺进入动脉并置入鞘管。鞘管置入后，静脉注射肝素3000–5000 IU，以维持活化凝血时间在250–300秒。
4. 肌肉注射胺碘酮（75 mg）作为负荷剂量。同时开始静脉输注含胺碘酮（75 mg）、阿托品（2 mg）和醋酸钾（20 mEq）的1000 ml生理盐水袋，输注速率维持在150 ml/hr，持续整个手术过程。
5. 将一根7 Fr的弯头导管（Cordis；美国佛罗里达州迈阿密）送至左冠状动脉，行冠状动脉造影。随后将一根0.014英寸的导引导丝（Abbott，美国伊利诺伊州帕克）送入前降支冠状动脉（LAD）。再将一根8 mm长、4.0 mm的VOYAGER球囊导管（Abbott，美国伊利诺伊州帕克）沿导丝送至前降支近段并定位，以3 atm压力扩张球囊。通过血管造影确认前降支闭塞。
6. 在持续心电图和血流动力学监测下，闭塞维持90分钟。在前40分钟内可能偶尔出现恶性室性心律失常，此时应立即给予200 J至300 J的直流电击除颤。通常心律失常有两个高峰时段，分别出现在球囊扩张后2–10分钟和25–35分钟。密切监测并及时除颤是成功建立心肌梗死模型的关键，因为在上述时间段内发生心室颤动的概率超过95%。若及时进行恰当的除颤，存活率非常高。若血压降至80 mmHg以下，应通过快速静脉输注生理盐水进行容量负荷补充。
7. 放气撤除球囊，并移除所有器械。
8. 从股动脉撤出鞘管，停止麻醉，动物在恢复期间持续监测。静脉输注的生理盐水含胺碘酮、阿托品和醋酸钾，输注速率降至50 ml/hr，并持续过夜。肌肉注射硝酸甘油和呋塞米。随后允许动物恢复，并继续进行至少3小时的严密心电图监测。
9. 术后口服阿司匹林（200 mg），连续给药5天。

心肌梗死造模过程中及术后常见的并发症包括冠状动脉夹层、穿刺部位血肿、心律失常和心力衰竭。为预防和处理这些并发症，需要采用优化的技术并进行严密的监测。

2. 病毒注射

1. 按照上述心肌梗死造模步骤1-3准备动物。应给予相同剂量的肝素，以预防病毒注射期间发生血栓形成。
2. 将一根5Fr曲棍球棒导管（Cordis；Miami, FL）送至左冠状动脉。完成血管造影后，送入两根0.014英寸的导丝，一根进入前降支（LAD），另一根进入左回旋冠状动脉（LCX），以固定导管位置。
3. 从导管中抽取动脉血（约20 ml）。为防止灌注期间发生缺血，使用半量稀释的血液作为溶液。将病毒与10 ml血液混合，并用生理盐水稀释至20 ml。剩余的10 ml血液也稀释至20 ml，用于输送导管腔内残留的病毒。
4. 通过耳静脉开始静脉输注硝酸甘油（20 μg/min）。
5. 将导管尖端置于左主干近端。监测导管内的压力，以确保导管未发生嵌顿。
6. 使用输液泵将15 ml病毒混合血液在15分钟内经导管注入左冠状动脉。15分钟后更换为冲洗液注射器，继续灌注10分钟。
7. 以与左冠状动脉相同的方式，将导丝和导管固定至右冠状动脉。
8. 将剩余5 ml含病毒的血液在5分钟内注入右冠状动脉，随后进行10分钟的冲洗。

3. 典型案例

图1显示了心肌梗死造模后1个月的左心室造影。左心室壁运动明显受损，射血分数（EF）为31%。图2显示了1个月时左心室的横断面图像，可见从前壁基底部至心尖部的大范围瘢痕组织。在此模型中，心肌梗死后1个月的平均射血分数为36%，平均舒张末期容积为83 ml；而在相同体型但未发生心肌梗死的动物中，相应平均值分别为68%和42 ml。图3显示了心肌梗死后1个月，腺相关病毒（rAAV1 CMV Lac-Z，2 × 10¹² DNA酶抗性颗粒）注射后左心室边缘区的β-半乳糖苷酶（beta-gal）表达情况。在病毒注射区域观察到增强的表达信号。

图1. 心肌梗死造模后1个月通过左心室造影测得的射血分数。左心室扩张至92.5 ml，前壁运动明显受损。

图 2. 心肌梗死造模后 1 个月的左心室横切面，经氯化三苯基四氮唑染色以显示瘢痕区域。可见从前壁基底部至心尖的大范围瘢痕。

图3. 腺相关病毒（rAAV1 CMV Lac-Z，2 × 10¹² DNA酶抗性颗粒）诱导的β-半乳糖苷酶表达。冠状动脉内注射病毒1个月后，在梗死区域与正常组织交界的边缘区观察到增强的表达。右下角图像为阴性对照，采用相同方案向冠状动脉内仅注射生理盐水。

讨论

在心力衰竭的多种病因中，缺血是迄今为止最常见的病因。为了应对这一严重疾病，目前正在开发多种治疗策略。在将这些有前景的治疗方法应用于临床之前，必须对其进行严格的评估。因此，建立能够代表患者临床状况的缺血性心力衰竭模型，对于心力衰竭治疗策略的开发至关重要。我们的猪心肌梗死模型满足了这些转化医学的要求。

为了通过制造心肌梗死来诱导心力衰竭，需要形成较大面积的梗死区域。与先前同样采用经血管心肌梗死模型的研究相比，本模型产生的瘢痕更大¹。我们发现，在冠状动脉闭塞期间给予胺碘酮并维持血压在80 mmHg以上，对于提高存活率和扩大梗死面积至关重要。虽然异氟烷是该手术有效的麻醉剂^1-2，但我们发现使用丙泊酚更有利于维持较高的血压。此外，有报道称异氟烷相比丙泊酚具有更强的心脏保护作用³，这可能导致梗死面积减小。

心脏基因治疗目前已成为治疗心力衰竭最有前景的方法之一，存在多种基因转移策略。其中，冠状动脉内注射携带基因的病毒载体是一种简单且侵入性较小的技术。已有多种尝试用于提高基因表...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
替拉唑	Fort Dodge Animal Health	0856-9050-49
丙泊酚	APP Pharmaceuticals	63323-270-20
肝素	APP Pharmaceuticals	63323-540-11
胺碘酮	APP Pharmaceuticals	63323-616-03
硫酸阿托品	Med-Pharmex	54925-063-10
乙酸钾	American Regent Inc.	2053-25
硝酸甘油	American Regent Inc.	4810-25
速尿灵（呋塞米）	Intervet Inc.	710461
5 Fr 曲棍球棒导管	Cordis	556-278-0L
7 Fr 曲棍球棒导管	Cordis	778-278-00
冠状动脉导丝	Abbott Laboratories	1044588
冠状动脉球囊	Abbott Laboratories	1009447-08
8Fr 鞘管	Terumo Medical Corp.	RSS801