本研究建立了一种简单的槽点印迹法，利用针对流感病毒血凝素和神经氨酸酶最保守序列的通用抗体，对其进行定量分析，这些保守序列通过生物信息学分析确定。该创新方法可能为所有病毒血凝素和神经氨酸酶的定量测定提供一种有用的替代方案。
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使用通用抗体通过简易槽印迹法对所有A型流感病毒血凝素和神经氨酸酶进行定量分析
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摘要
摘要
血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）是流感病毒的两种表面蛋白，在病毒生命周期及诱导保护性免疫反应中发挥重要作用1,2。作为中和抗体的主要靶点，HA 目前被用作流感疫苗效力的标志物，并通过单向免疫扩散法（SRID）进行测定3。然而，SRID 方法依赖于相应亚型特异性抗血清的可获得性，导致每种新疫苗的上市至少延迟 2–3 个月。此外，尽管已有证据表明 NA 同样可诱导保护性免疫4，但由于缺乏合适的试剂或分析方法，流感疫苗中 NA 的含量尚未实现标准化5。因此，开发能够快速定量 HA 和 NA 抗原的简便替代方法，对于加快疫苗上市速度并提高质量控制水平具有重要意义。
通过对所有可获得的甲型流感病毒HA和NA序列进行生物信息学分析，鉴定出其中普遍保守的区域6-7。在HA唯一普遍保守的表位——融合肽区域中鉴定出一个序列（命名为Uni-1）6，而在神经氨酸酶（NA）中鉴定出两个保守序列，其中一个靠近酶活性位点（命名为HCA-2），另一个靠近N端（命名为HCA-3）7。根据这些氨基酸序列合成了多肽，并用于免疫兔子以制备抗体。抗HA Uni-1表位的抗体能够结合13种甲型流感病毒HA亚型（H1-H13），而抗NA HCA-2和HCA-3区域的抗体则能够结合全部9种NA亚型。所有抗体均表现出对病毒序列的高度特异性，表现为未检测到与尿囊液蛋白的任何交叉反应。这些通用抗体随后被用于建立槽印迹（slot blot）检测方法，以在无需特异性抗血清的情况下定量甲型流感疫苗中的HA和NA含量7,8。将疫苗样品与不同浓度的参考标准品一同通过槽印迹装置加样至PVDF膜上。在HA检测中，样品和标准品首先用含有4M尿素的Tris缓冲盐水（TBS）稀释；而在NA检测中，则用含有0.01%两性离子去污剂（Zwittergent）的TBS稀释，因为这些条件显著提高了检测灵敏度。随后，利用相应的通用抗体通过免疫印迹法检测HA和NA抗原，再通过密度测定法对信号强度进行定量。最后，根据参考标准品不同浓度所获得的信号强度绘制的标准曲线，计算疫苗中HA和NA的含量。
由于这些抗体可结合 HA 或 NA 中的通用表位，因此感兴趣的科研人员可将其作为免疫分析的研究工具，不仅限于槽印迹法。
方案
1. 试剂与仪器的准备
- 开始进行槽印迹实验前，配制20毫升含有4M尿素的Tris缓冲盐水（20 mM Tris，137 mM NaCl，pH 7.6）（TBS），用于血凝素（hemagglutinin，HA）槽印迹；或配制20毫升含有0.01% Zwittergent的TBS溶液，用于神经氨酸酶（neuraminidase，NA）槽印迹。4M尿素溶液每次均需新鲜配制，而10% Zwittergent母液在dH2O中室温下可稳定保存至少6个月，因此可在每次实验前用TBS稀释至0.01%。
- 向TBS溶液中加入Tween-20，配制2000毫升洗涤缓冲液，使其终浓度为0.1%。将脱脂奶粉（印迹级无脂干奶粉）以5% w/v的终浓度溶解于洗涤缓冲液中，配制80毫升封闭缓冲液。
- 将PVDF膜（预先裁剪为9 × 12 cm大小）在甲醇中活化15秒，随后用ddH2O冲洗2分钟。将膜浸泡于TBS中备用。将3张Bio-Dot SF滤纸预先用TBS浸湿，待用。
2. 流感疫苗样品及血凝素（HA）槽点印迹法参考标准品的制备
用于血凝素（HA）定量的槽印迹法检测中，需使用已知HA含量的流感疫苗参考标准品，这些标准品应与待测疫苗株相对应，可从美国生物制品评价与研究中心（CBER/FDA，美国）或英国国家生物标准与控制研究所（NIBSC，英国）获得。研究者也可依据文献9和10中所述的既定方法自行制备抗原标准品。
- 对于血凝素（HA）参考抗原和测试疫苗样品：将HA参考抗原原液用4M尿素/TBS稀释至以下浓度：0、0.0938、0.1875、0.375、0.75、1.5、3和6 μg HA/ml，充分混匀。然后，将来自疫苗生产商或实验室自制用于科学研究的供人用测试疫苗样品用4M尿素/TBS稀释，并充分混匀。参考抗原和疫苗样品可设复孔，但建议设三复孔。每份样品准备3个稀释度（稀释倍数相差2倍），以确保样品浓度落在标准曲线范围内。为进行双复孔或三复孔检测，分别准备每种参考抗原或测试疫苗样品稀释液450 μl或650 μl。单价甲型流感疫苗可采用此槽印迹法进行检测。参考抗原的HA含量此前已通过单向免疫扩散法（SRID）测定，该方法是目前流感疫苗制备所采用的标准检测方法。槽印迹标准曲线稀释液制备时，初始参考抗原原液的HA浓度即采用SRID测定的结果。
3. 流感疫苗样本及神经氨酸酶检测槽印迹法参考标准品的制备
用于检测疫苗毒株的流感疫苗参考标准品购自美国生物制品评价与研究中心（CBER/FDA，美国）或英国国家生物标准与控制研究所（NIBSC，英国），并用于槽印迹法（slot blot）中的神经氨酸酶（NA）定量。这些参考样品中的NA含量通过去糖基化样品的SDS-PAGE分析结合密度扫描分析测定，方法如先前所述9，并略有修改10。简言之，将5 μg去糖基化的疫苗参考样品与上样缓冲液混合后上样至凝胶。以20 mA电流电泳约90分钟，直至示踪染料刚好跑出凝胶，随后进行Sypro染色。使用Fluorchem凝胶成像系统（Alpha Innotech）进行蛋白质的密度扫描定量。NA的含量根据Lowry法测定的NA蛋白占总蛋白的比例确定。采用该方法制备的参考样品可用于槽印迹法对疫苗生产企业提供的疫苗样品中的NA含量进行定量。
- 对于神经氨酸酶（NA）参考抗原和测试疫苗样品：将NA参考抗原原液用含0.01% Zwittergent的TBS缓冲液稀释至以下浓度：0、0.039、0.078、0.1562、0.3125、0.625、1.25、2.5、5 和 10 μg NA/ml，充分混匀。随后，将来自疫苗生产商或实验室自制用于科学研究的人用测试疫苗样品用含0.01% Zwittergent的TBS缓冲液进行稀释，并充分混匀。参考抗原和疫苗样品可设置重复孔，但建议设置三重复孔。每个样品准备3个稀释度（稀释倍数相差2倍），以确保样品浓度落在标准曲线范围内。根据需要进行双复孔或三复孔检测，每种参考抗原或测试疫苗样品稀释液分别准备450 μl或650 μl。单价甲型流感疫苗可采用本槽印迹法进行检测。
4. 生物点样SF微滤装置的组装及样品在PVDF膜上的点样
- 组装一个先前已清洁并干燥的 Bio-Dot SF 微孔过滤装置。将垫圈支撑板放入真空 manifold 中，并将密封垫圈放置在其上方。将 3 张已润湿的 Bio-Dot SF 滤纸覆盖在垫圈上，随后放上预先浸泡的 PVDF 膜。将样品模板置于膜上，并按照对角交叉模式用手拧紧四个螺丝，以确保膜表面受力均匀。
- 在打开泵并连接真空之前，确认三通阀处于仅使真空 manifold 与真空源连通的位置。
- 打开泵并连接至 Bio-Dot 装置。确保流量阀的位置低于样品孔，以便在后续步骤中实现样品的快速且充分的排液。
- 再次按照对角交叉模式拧紧螺丝。在施加真空的同时拧紧螺丝，可确保更紧密的密封，防止孔间交叉污染。
- 将流量阀调至使 manifold 与空气连通，并关闭泵。
- 使用多通道移液器向所有孔中加入 100 μl TBS，以重新水化膜，从而确保抗原的均匀结合。操作时需避免产生气泡，并尽可能靠近孔底部的中央位置加样，以使槽孔表面被均匀覆盖。若意外引入气泡，应使用移液器吸头将其刺破消除。
- 将流量阀调整至使 manifold 同时与空气和真空连通，打开泵，并通过用手指堵住通气口来调节真空度，从而轻柔地将孔中的缓冲液排干。
- 一旦所有孔中的缓冲液完全排干，立即将流量阀调至使 manifold 与空气连通，并关闭泵或断开真空连接。
- 每孔加入 200 μl 各标准品或疫苗样品稀释液。逐孔加样，将样品加至每孔中央，尽可能靠近孔底，注意避免引入气泡。若意外引入气泡，应使用移液器吸头将其刺破消除。对于未使用的孔，加入 200 μl 样品稀释缓冲液（4M 尿素/TBS 或 0.01% Zwittergent/TBS），以确保使用中的孔获得适当的真空作用。
- 调节流量阀，使 manifold 同时与空气和真空连通。打开泵（或重新连接真空），并通过用手指堵住通气口来控制真空强度，使样品缓慢且完全地从孔中排干。当所有样品排干后，立即移开手指释放真空。
- 立即使用多通道移液器向每孔加入 200 μl TBS。通过用手指堵住通气口控制真空强度，施加轻柔真空以排干并洗涤孔。
- 重复步骤 4.11 中描述的洗涤步骤。一旦孔完全排干，立即松开样品模板的螺丝并关闭真空，以避免孔过度干燥。随后立即进行膜的取出操作。
- 将膜放入封闭缓冲液中，在 4°C 下轻轻摇动孵育过夜。使用足量的封闭缓冲液以完全覆盖膜。
5. HA 和 NA 抗原的免疫印迹
- 在封闭缓冲液中过夜孵育后，用含0.1% Tween-20的TBS洗涤缓冲液洗涤膜两次，每次5分钟。所有洗涤和孵育步骤中，均需确保膜完全被溶液覆盖。
- 将膜与针对HA（如Uni-1）或NA（如HCA-2或HCA-3）的通用兔源抗体在洗涤缓冲液中稀释后进行孵育，抗体稀释液中含有5%（w/v）BSA，室温下轻柔振荡孵育1小时。每种抗体原液的最佳浓度需自行确定。对于上述抗体，使用1:4000稀释度的兔抗血清可获得最佳结果。
- 用洗涤缓冲液在室温下轻柔振荡洗涤膜三次，每次15分钟，以去除未结合的一抗。
- 将膜与HRP标记的抗兔二抗孵育。使用Thermo ImmunoPure Goat anti-rabbit IgG（过氧化物酶标记抗体）按1:50000稀释于封闭缓冲液中，室温轻柔振荡孵育30分钟。
- 用洗涤缓冲液在室温下轻柔振荡洗涤膜三次，每次15分钟，以去除未结合的二抗。
- 用TBS缓冲液轻柔振荡洗涤膜5分钟，以去除膜表面残留的Tween-20去污剂。
- 取Thermo Scientific Supersignal West Dura Extended Duration Substrate试剂盒中的两种试剂各3 ml，混合均匀，配制底物溶液。
- 将膜置于干燥的纸巾上，轻轻吸去多余的TBS缓冲液。
- 将膜转移至干燥容器中，加入底物溶液使其完全覆盖膜，室温下轻柔振荡孵育5分钟。
- 将膜在纸巾上轻轻吸印，去除多余底物。
- 将膜暴露于化学发光胶片上。曝光时间需优化以避免信号饱和，通常在10秒至10分钟之间。
- 使用凝胶成像系统（如Alpha Innotech的Fluorchem凝胶成像系统），按照制造商说明对显影胶片进行密度分析。对参考抗原和待测疫苗样本的每组重复实验的密度值取平均值。虽然抗原标准品和疫苗样本可做双复孔，但建议进行三复孔。重复样本的密度值应非常接近；若重复样本间差异显著，则提示实验过程中可能存在技术问题。通过将参考标准品中各加样孔所加入的HA或NA抗原量（ng）与其对应的平均密度值作图，建立浓度依赖性标准曲线。在免疫测定中采用适当的校准曲线拟合方法，对准确量化HA和NA至关重要。线性回归法是最简单的分析物定量方法，即利用响应值（y）对浓度（x）作图，取响应曲线的线性部分进行拟合（y = mx + b）。若需在更宽的分析物浓度范围内进行定量，应采用目前公认的四参数逻辑（4PL）模型。多种软件可供研究人员选择。在本研究所述的槽印迹实验中，将x轴数据转换为对数刻度后，曲线可拟合4-PL模型，从而可采用变斜率非线性回归方法计算待测疫苗样本中印迹的HA和NA含量。因此，我们常规使用该模型进行数据分析。由于待测疫苗样本在点样前已用4M尿素/TBS或0.01% Zwittergent/TBS稀释，因此在确定原始待测疫苗样本中HA和NA含量时，必须考虑各样本的稀释倍数。建议每个待测疫苗样本设置三个不同稀释度（两倍梯度稀释），以确保至少一组密度值落在标准曲线范围内。若所有稀释度的密度值均高于标准曲线范围，则需对样本进一步稀释，以实现HA或NA的准确量化。若密度值低于标准曲线最低端，则应降低样本稀释倍数重新检测。
6. 代表性结果：
对所有可获得的甲型流感病毒HA序列进行的生物信息学分析证实，HA2亚基的N端（即融合肽）是HA中唯一保守的区域。图1显示了鉴定出的共识序列中每个氨基酸位点的保守率。在第2位点发现了两种变异（L—>I）和12（G—>N）的14个N端氨基酸，但这些变异并未影响抗体与肽段变体之间的结合6Uni-1 表位（GLFGAIAGFIEGGW）被选用于开发针对血凝素（HA）的通用抗体。该抗体对病毒序列表现出显著的特异性，能够结合13种不同的甲型流感病毒HA亚型（H1-H13）（图2）。
采用类似方法，在所有甲型流感病毒神经氨酸酶（NA）中鉴定出两个普遍保守的序列，其中一个位于酶活性位点附近（HCA-2）（图3A），另一个位于N端（HCA-3）（图3B）。含有这些氨基酸序列的多肽被用作抗原，以产生针对NA的通用抗体。针对这两个表位的抗体均能结合所有9种NA亚型，且几乎不与尿囊液或细胞蛋白发生交叉反应，表明其对病毒NA序列具有高度特异性（图4）。
图5展示了用于定量流感病毒HA和NA的槽点印迹法的示意图。
HA和NA抗原槽印迹分析的示例如图6和图7所示。图6A和6C分别显示了在流感疫苗参考标准品和疫苗样品中检测HA抗原后的代表性结果。每个样品（标准品或疫苗）均在相邻的孔中重复点样两次，检测后重复样品的信号强度应相似。根据所用抗体的不同，可能需要对抗体稀释度、孵育时间和曝光时间进行优化。
图6B展示了通过检测疫苗参考标准品样品中不同浓度HA后获得的典型标准曲线示例。HA抗原的浓度与槽印迹化学发光检测后的信号强度成正比，并在该浓度范围（0.0938至6 μg HA/ml）内符合四参数逻辑（4-PL）曲线拟合模型。
图7展示了在流感疫苗参考标准品和疫苗样品中检测NA抗原的代表性结果。密度分析显示，通过槽印迹法检测疫苗参考标准品不同稀释度中的NA抗原所获得的信号强度与NA浓度成正比（图7A）。在该浓度范围（0.039至10 μg NA/ml）内，所得标准曲线符合四参数逻辑模型（4-PL模型），如图7B所示。图7C展示了流感疫苗样品中NA含量的槽印迹分析示例。每个样品均在相邻孔中进行双份检测。
图1. 流感A型HA融合肽区域Uni-1表位的保守性比率
对所有可获得的甲型流感病毒HA序列进行的生物信息学分析证实，融合肽（位于HA2亚基的N端）是HA中唯一普遍保守的区域。注意第2位点存在的两种变异（L—>I）和12（G—>N）被发现不影响抗体结合6一种能够结合13种不同甲型流感病毒血凝素亚型（H1-H13）的通用抗体已基于Uni-1表位（GLFGAIAGFIEGGW）开发而成。
图2. 使用针对HA的通用抗体检测13种HA亚型。
在鸡胚中增殖的13种甲型流感病毒亚型的尿囊液经SDS-PAGE分离后，使用针对HA Uni-1表位的通用抗体检测HA蛋白。使用兔源多克隆NP特异性抗体检测NP蛋白作为上样对照。阴性对照（-）为未感染鸡胚的尿囊液。阳性对照（+）为来自英国国家生物标准与检定所（NIBSC）的H1参考标准品。
图 3. 流感病毒A型神经氨酸酶（NA）在酶活性位点附近及N端的序列同源性。
通过生物信息学分析，在流感病毒A型NA中鉴定出两个普遍保守的序列：一个位于酶活性位点附近（HCA-2）（图A），另一个位于N端（HCA-3）（图B）。合成包含这些保守氨基酸序列的多肽，并用于制备针对NA的通用抗体。
图 4. 利用 NA 抗体检测 9 种 NA 亚型。
在鸡胚中增殖的甲型流感病毒九种 NA 亚型的尿囊液经 SDS-PAGE 分离后，使用 HCA-2（A 图）和 HCA-3（B 图）抗体检测 NA 蛋白。使用兔源多克隆 NP 特异性抗体检测 NP 蛋白作为上样对照（C 图）。阴性对照（-）为未感染鸡胚的尿囊液。阳性对照（+）为添加了 A/New Caledonia/20/99 的 rNA1 的尿囊液，并用相应的抗血清进行检测。
图 5. 流感疫苗中 HA 和 NA 抗原定量的狭缝印迹法流程图。
首先配制用于样品稀释、膜洗涤和封闭所需的缓冲液，并将用于组装 Bio-Dot SF 微滤装置的 PVDF 膜和滤纸预先浸泡。流感疫苗样品及参考标准品使用针对 HA 或 NA 检测优化的缓冲液进行稀释。按照生产商说明书组装 Bio-Dot SF 微滤装置，并将样品加至 PVDF 膜上。使用针对每种抗原的通用抗体检测 HA 和 NA 抗原。对获得的化学发光信号进行光密度分析，以定量检测样品中的 HA 和 NA 含量。
图6. 流感疫苗样品及参考标准品中HA抗原的检测。
图A显示了通过免疫检测HA抗原后获得的代表性印迹结果。将HA参考抗原用4M尿素/TBS缓冲液稀释至0至6 μg HA/ml的不同浓度，疫苗样品则稀释至0.375 μg HA/ml，随后使用Bio-Dot SF微滤装置将其加样至PVDF膜上。然后使用Uni-1通用抗体检测HA抗原。图B显示了通过检测疫苗参考标准品中不同HA浓度信号所获得的标准曲线示例。信号强度与HA浓度成正比，曲线符合四参数逻辑（4-PL）模型。
图 7. 流感疫苗样品及参考标准品中 NA 抗原的检测。
图 A 和图 B 显示了在 0.01% Zwittergent/TBS 中将流感疫苗参考标准品稀释至 NA 浓度为 0–10 μg NA/ml 后，检测 NA 所得的代表性信号，以及经密度分析后生成的四参数逻辑（4-PL）标准曲线。图 C 展示了对流感疫苗样品中 NA 抗原进行槽印迹分析后检测到的典型化学发光信号示例。流感疫苗样品用 0.01% Zwittergent/TBS 稀释至 1 μg HA/ml 的浓度，并使用 Bio-Dot SF 微孔过滤装置印迹到 PVDF 膜上。同时，在同一印迹膜上包含相应疫苗参考标准品的系列稀释液（浓度范围为 0–2.5 μg NA/ml），以建立用于定量疫苗样品中 NA 抗原的标准曲线。使用针对 NA 的 HCA-2 通用抗体检测 NA 抗原，并对获得的化学发光信号进行密度分析。通过将疫苗参考标准品的信号强度值对其 NA 浓度作图所得到的四参数逻辑（4-PL）标准曲线，可计算出每种疫苗样品中 NA 的含量。
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讨论
流感病毒HA和NA的定量测定对于疫苗的研发至关重要，因为这两种表面蛋白是诱导免疫反应最重要的病毒组分6-11。以往报道的检测这些蛋白的免疫学方法需要使用针对特定毒株的抗体。本文所述的槽印迹法（slot blot）操作简便、可重复且快速，适用于所有甲型流感病毒的HA和NA抗原定量，因为所用抗体识别的是这两类蛋白中唯一普遍保守的表位6-8。对该方法感兴趣的科研人员可能面临的唯一困难是实验室缺乏此类通用抗体。然而，利用多肽作为抗原制备这些抗体属于常规实验操作。由于不同变异多肽在竞争性ELISA中与特定多肽结合的能力相当6-8，有需求的科研人员可依照所述方法自行制备抗体，也可联系作者获取可用于探索性研究的HA和NA抗体。
关于槽点印迹法，该方法相当直接，只需在上述少数步骤中特别注意即可。尽管在未经处理的样本中均可检测到HA和NA，但通过对样本进行预处理可提高检测灵敏度。
尽管基于通用抗体的槽印迹法具有操作简便、快速和可重复性等优点，但本文所述的方法仍存在某些局限性。例如...
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致谢
作者感谢Monika Tocchi女士对稿件的编辑审阅。AMH由加拿大沙特阿拉伯文化局通过阿卜杜勒-阿齐兹国王大学的奖学金资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 生物点样 SF 微孔过滤装置 | Bio-Rad | 170-6542 | |
| 生物点样 SF 滤纸 | Bio-Rad | 162-0161 | |
| Immobilon-FL 转膜膜（PVDF） | EMD Millipore | IPFL00010 | |
| 真空泵 | EMD Millipore | WP6111560 | |
| 化学发光 BioMax Light 胶片 | Kodak | 178 8207 | |
| FluorChem 凝胶成像系统 | Alpha Innotech | 29-008-1896X | |
| 针对 HA 和 NA 抗原的通用兔源抗体 | Uni-1 (HA)HCA-2, HCA-3 (NA) | 抗体可通过材料转让协议（MTA）获得，或由感兴趣的科研人员根据先前描述的方法自行制备6,7。 | |
| 流感疫苗参考抗原 | CBER/FDA 或 NIBSC | ||
| 流感疫苗样品 | 在大多数国家均可常规获取 | ||
| 尿素 | Sigma-Aldrich | U1250 | |
| 两性离子去垢剂 Zwittergent 3-14 | Calbiochem | 693017 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| 印迹级封闭剂 脱脂奶粉 | Bio-Rad | 170-6404 | |
| ImmunoPure 山羊抗兔 IgG（H+L），辣根过氧化物酶标记 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 31460 | |
| SuperSignal West Dura 长效底物 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 34075 |
参考文献
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重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays
Posted by JoVE Editors on 11/13/2012. Citeable Link.
An author's affiliation was omitted from the publication of Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays.
