本研究建立了一种简单的槽点印迹法，利用针对流感病毒血凝素和神经氨酸酶最保守序列的通用抗体，对其进行定量分析，这些保守序列通过生物信息学分析确定。该创新方法可能为所有病毒血凝素和神经氨酸酶的定量测定提供一种有用的替代方案。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
方法文章
使用通用抗体通过简易槽印迹法对所有A型流感病毒血凝素和神经氨酸酶进行定量分析
* These authors contributed equally
本文内容
勘误通知
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
摘要
摘要
血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）是流感病毒的两种表面蛋白，在病毒生命周期及诱导保护性免疫反应中发挥重要作用1,2。作为中和抗体的主要靶点，HA 目前被用作流感疫苗效力的标志物，并通过单向免疫扩散法（SRID）进行测定3。然而，SRID 方法依赖于相应亚型特异性抗血清的可获得性，导致每种新疫苗的上市至少延迟 2–3 个月。此外，尽管已有证据表明 NA 同样可诱导保护性免疫4，但由于缺乏合适的试剂或分析方法，流感疫苗中 NA 的含量尚未实现标准化5。因此，开发能够快速定量 HA 和 NA 抗原的简便替代方法，对于加快疫苗上市速度并提高质量控制水平具有重要意义。
通过对所有可获得的甲型流感病毒HA和NA序列进行生物信息学分析，鉴定出其中普遍保守的区域6-7。在HA唯一普遍保守的表位——融合肽区域中鉴定出一个序列（命名为Uni-1）6，而在神经氨酸酶（NA）中鉴定出两个保守序列，其中一个靠近酶活性位点（命名为HCA-2），另一个靠近N端（命名为HCA-3）7。根据这些氨基酸序列合成了多肽，并用于免疫兔子以制备抗体。抗HA Uni-1表位的抗体能够结合13种甲型流感病毒HA亚型（H1-H13），而抗NA HCA-2和HCA-3区域的抗体则能够结合全部9种NA亚型。所有抗体均表现出对病毒序列的高度特异性，表现为未检测到与尿囊液蛋白的任何交叉反应。这些通用抗体随后被用于建立槽印迹（slot blot）检测方法，以在无需特异性抗血清的情况下定量甲型流感疫苗中的HA和NA含量7,8。将疫苗样品与不同浓度的参考标准品一同通过槽印迹装置加样至PVDF膜上。在HA检测中，样品和标准品首先用含有4M尿素的Tris缓冲盐水（TBS）稀释；而在NA检测中，则用含有0.01%两性离子去污剂（Zwittergent）的TBS稀释，因为这些条件显著提高了检测灵敏度。随后，利用相应的通用抗体通过免疫印迹法检测HA和NA抗原，再通过密度测定法对信号强度进行定量。最后，根据参考标准品不同浓度所获得的信号强度绘制的标准曲线，计算疫苗中HA和NA的含量。
由于这些抗体可结合 HA 或 NA 中的通用表位，因此感兴趣的科研人员可将其作为免疫分析的研究工具，不仅限于槽印迹法。
方案
1. 试剂与仪器的准备
- 开始进行槽印迹实验前，配制20毫升含有4M尿素的Tris缓冲盐水（20 mM Tris，137 mM NaCl，pH 7.6）（TBS），用于血凝素（hemagglutinin，HA）槽印迹；或配制20毫升含有0.01% Zwittergent的TBS溶液，用于神经氨酸酶（neuraminidase，NA）槽印迹。4M尿素溶液每次均需新鲜配制，而10% Zwittergent母液在dH2O中室温下可稳定保存至少6个月，因此可在每次实验前用TBS稀释至0.01%。
- 向TBS溶液中加入Tween-20，配制2000毫升洗涤缓冲液，使其终浓度为0.1%。将脱脂奶粉（印迹级无脂干奶粉）以5% w/v的终浓度溶解于洗涤缓冲液中，配制80毫升封闭缓冲液。
- 将PVDF膜（预先裁剪为9 × 12 cm大小）在甲醇中活化15秒，随后用ddH2O冲洗2分钟。将膜浸泡于TBS中备用。将3张Bio-Dot SF滤纸预先用TBS浸湿，待用。
2. 流感疫苗样品及血凝素（HA）槽点印迹法参考标准品的制备
用于血凝素（HA）定量的槽印迹法检测中，需使用已知HA含量的流感疫苗参考标准品，这些标准品应与待测疫苗株相对应，可从美国生物制品评价与研究中心（CBER/FDA，美国）或英国国家生物标准与控制研究所（NIBSC，英....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
流感病毒HA和NA的定量测定对于疫苗的研发至关重要，因为这两种表面蛋白是诱导免疫反应最重要的病毒组分6-11。以往报道的检测这些蛋白的免疫学方法需要使用针对特定毒株的抗体。本文所述的槽印迹法（slot blot）操作简便、可重复且快速，适用于所有甲型流感病毒的HA和NA抗原定量，因为所用抗体识别的是这两类蛋白中唯一普遍保守的表位6-8。对该方法感兴趣的科研人员可能面临的唯一困难是实验室缺乏此类通用抗体。然而，利用多肽作为抗原制备这些抗体属于常规实验操作。由于不同变异多肽在竞争性ELISA中与特定多肽结合的能力相当6-8，有需求的科研人员可依照所述方法自行制备抗体，也可联系作者获取可用于探索性研究的HA和NA抗体。
关于槽点印迹法，该方法相当直接，只需在上述少数步骤中特别注意即可。尽管在未经处理的样本中均可检测到HA和NA，但通过对样本进行预处理可提高检测灵敏度。
尽管基于通用抗体的槽印迹法具有操作简便、快速和可重复性等优点，但本文所述的方法仍存在某些局限性。例如.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
致谢
作者感谢Monika Tocchi女士对稿件的编辑审阅。AMH由加拿大沙特阿拉伯文化局通过阿卜杜勒-阿齐兹国王大学的奖学金资助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 生物点样 SF 微孔过滤装置 | Bio-Rad | 170-6542 | |
| 生物点样 SF 滤纸 | Bio-Rad | 162-0161 | |
| Immobilon-FL 转膜膜（PVDF） | EMD Millipore | IPFL00010 | |
| 真空泵 | EMD Millipore | WP6111560 | |
| 化学发光 BioMax Light 胶片 | Kodak | 178 8207 | |
| FluorChem 凝胶成像系统 | Alpha Innotech | 29-008-1896X | |
| 针对 HA 和 NA 抗原的通用兔源抗体 | Uni-1 (HA)HCA-2, HCA-3 (NA) | 抗体可通过材料转让协议（MTA）获得，或由感兴趣的科研人员根据先前描述的方法自行制备6,7。 | |
| 流感疫苗参考抗原 | CBER/FDA 或 NIBSC | ||
| 流感疫苗样品 | 在大多数国家均可常规获取 | ||
| 尿素 | Sigma-Aldrich | U1250 | |
| 两性离子去垢剂 Zwittergent 3-14 | Calbiochem | 693017 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| 印迹级封闭剂 脱脂奶粉 | Bio-Rad | 170-6404 | |
| ImmunoPure 山羊抗兔 IgG（H+L），辣根过氧化物酶标记 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 31460 | |
| SuperSignal West Dura 长效底物 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 34075 |
参考文献
- Webster, R. G., Bean, W. J. Genetics of influenza virus. Annu Rev Genet. 12, 415-431 (1978).
- Skehel, J. J., Wiley, D. C. Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin. Annu Rev Biochem. 69, 531-569 (2000).
- Wood, J. M.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays
Posted by JoVE Editors on 11/13/2012. Citeable Link.
An author's affiliation was omitted from the publication of Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays.
标签
