我们提出了一种非侵入性取样方法，可高效地从难以捕捉的小型哺乳动物（如美洲鼠兔）身上收集毛发样本。通过从所采集的毛发中提取DNA，并扩增多种常用于野生动物生态学与保护研究的分子标记物，我们展示了该方法的有效性。
本文内容
摘要
摘要
非侵入性遗传取样方法在野生动物种群研究中正变得越来越重要。已有若干研究报道采用非侵入性取样技术来调查野生种群的群体遗传学与种群统计学特征1。当研究对象为稀有或难以捕捉的物种时，该方法已被证明尤为有效2。尽管已有多种方法被开发用于从食肉动物和中型哺乳动物身上采集毛发、粪便及其他生物材料，但这些方法在难以捕捉的小型哺乳动物中的应用仍鲜有验证。在本视频中，我们介绍一种新颖、低成本且非侵入性的毛发捕获装置，专门针对一种难以捕捉的小型哺乳动物——美洲鼠兔（Ochotona princeps）。我们描述了该毛发捕获装置的总体设置，该装置由若干条胶带以网状形式排列，放置于鼠兔活动路径沿线。我们展示了该装置在收集大量毛发方面的高效性，所获样本可带回实验室进行后续分析。随后，我们演示了使用DNA IQ系统（Promega）提取DNA的过程，并展示了该方法在扩增常用分子标记方面的实用性，包括核微卫星标记、扩增片段长度多态性（AFLPs）、线粒体序列（800 bp）以及分子性别鉴定标记。总体而言，我们展示了这种新型非侵入性毛发捕获装置作为野生动物种群生物学家取样技术的有效性。我们预期该方法可广泛应用于多种小型哺乳动物，从而在自然种群中开辟新的研究领域，同时将对研究对象的影响降至最低。
方案
1. 毛发捕获法
在设置套索之前，必须在鼠兔栖息地或碎石坡中确定一个理想的位置。该位置包括干草堆（即动物在夏末收集的植物贮藏堆）以及在排泄点发现的新鲜粪便。将长度为10–50 cm的胶带条卷起，形成360°的粘性表面，并以网状方式布置，包裹住鼠兔干草堆（图1）或排泄点的入口。根据岩石的结构，可使用一段鱼线来支撑毛发套索的结构；但当入口较小时（直径<30 cm），通常无需使用鱼线。有关鱼线使用的完整描述，参见Henry和Russello（2010）3。应尽可能频繁地检查毛发套索，并收集粘在胶带上的毛发样本（图2），然后进行标记。样本运回实验室后，使用无菌镊子将毛发从粘性胶带上取下，转移至冻存管中，并在-20°C下保存，直至进一步处理。沿同一毛发套索上聚集在一起的毛发样本被视为来自同一个体，而彼此独立聚集的样本则被认为来自不同个体。在后一种情况下，应将毛发分别放入不同的管中。这些假设后续可通过微卫星基因型数据进行DNA指纹分析和个体同一性概率计算加以验证。
2. DNA 提取
由于鼠兔的毛发非常细，且毛根球极小，我们此前已证明，为获得足量的高质量DNA以进行后续PCR扩增，至少需要25根毛发3。我们采用DNA IQ系统（Promega，Madison，WI，USA），并根据制造商提供的说明书稍作修改，用于从毛发样本中提取DNA。首先，将毛发样本在微量离心机中离心，以避免打开管盖时毛发丢失。然后，通过将80 μl孵育液与10 μl DTT（1 M）和10 μl蛋白酶K（18 ng/ml）混合，配制孵育溶液，使DTT终浓度为0.1 M，蛋白酶K终浓度为1.8 ng/ml。向样本中加入100 μl孵育液，在56°C孵育1小时。在此期间，通过向每100 μl裂解缓冲液中加入1 μl DTT（1 M），配制裂解液，使DTT终浓度为0.01 M。向样本中加入200 μl配制好的裂解液，再加入7 μl DNA IQ树脂，高速涡旋振荡3秒，并在室温下孵育5分钟。随后将样本涡旋振荡2秒，放入磁力架中，使磁珠与溶液分离。小心吸除并弃去上清液，注意不要扰动磁性树脂沉淀。接着向样本中加入100 μl配制好的裂解液，涡旋振荡后再次放入磁力架中进行分离。吸除并弃去裂解缓冲液，随后使用洗涤缓冲液（100 μl）重复此步骤三次。之后将样本在磁力架中静置干燥15分钟。干燥后，向样本中加入100 μl洗脱缓冲液，在65 °C孵育5分钟。涡旋振荡样本后放入磁力架中，将含有洗脱DNA的溶液转移至1.5 ml Eppendorf管中，于-20°C保存，直至后续操作。肝脏样本的DNA也使用DNA IQ系统提取，并作为PCR扩增的阳性对照。
3. PCR 扩增
利用非侵入性毛发捕获法和肝脏样本提取的DNA，随后用于扩增一组常用的分子标记（微卫星标记、AFLP、线粒体细胞色素b基因以及ZFX/ZFY性别鉴定标记）。PCR反应在25 μL体系中进行，使用Veriti热循环仪（Applied Biosystems，美国加利福尼亚州福斯特城），反应体系包含：10–20 ng DNA、每种引物0.5 μM、10 mM Tris-HCl（pH 8.3）、50 mM KCl、1.5 mM MgCl2、200 μM dNTPs、10 μL牛血清白蛋白（BSA；New England Biolabs，美国马萨诸塞州伊普斯威奇）以及0.5 U AmpliTaq Gold DNA聚合酶（Applied Biosystems）。微卫星位点的扩增程序采用降落式PCR（touchdown PCR）进行优化：95°C预变性10分钟，随后进行35个循环（95°C变性30秒，退火30秒，72°C延伸45秒），最后在72°C延伸10分钟。退火温度从60°C开始，每个循环降低1°C，直至第6个循环达到55°C，之后剩余的29个循环均在55°C下进行。线粒体片段的扩增程序与上述相同，但采用35个循环，退火温度为50°C。扩增片段长度多态性（AFLP）分析按照Bonin4描述的脊椎动物基因组实验方案进行。最后，采用PCR-RFLP方法结合HinfI限制性内切酶消化对ZFX/ZFY位点进行分子性别鉴定5。微卫星、AFLP和细胞色素b基因的PCR产物在ABI 3130XL遗传分析仪（Applied Biosystems）上进行检测；而经酶切的ZFX/ZFY片段则与100 bp DNA分子量标记（New England Biolabs）一同在含2.5% SYBR Safe DNA染料（Invitrogen，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）的3%琼脂糖凝胶上电泳，并使用RED个人凝胶成像系统（Alpha Innotech，美国加利福尼亚州圣利安卓）进行观察。微卫星和AFLP数据使用Genemapper v3.7软件（Applied Biosystems）进行分析，线粒体DNA测序结果则使用Sequencher v4.7软件（Gene Code Corporation，美国密歇根州安娜堡）进行序列比对与可视化。
4. 代表性结果
利用非侵入性套索获取的毛发样品所提取的DNA，用于PCR扩增多种类型的分子标记。作为比较依据，同时对肝脏样品提取的DNA与毛发样品进行了扩增。毛发和肝脏样品的核微卫星位点均成功扩增（图3）。尽管使用肝脏样品时信号强度更高，但这并未对基因型判读产生不利影响（图3）。在使用AFLP（图4）、线粒体DNA序列（图5）以及ZFX/ZFY分子性别鉴定标记（图6）时，也获得了类似结果。
图 1. 在干草堆处设置的无创毛发捕获装置示例。将卷起的透明封箱胶带条以网状方式排列，围住干草堆的入口。此处使用一段鱼线为毛发捕获装置提供额外支撑。
图 2. 一个成功的毛发捕获装置，其中粘附了大量粘在封箱胶带上的毛发。
图3. 在Genemapper v3.7（Applied Biosystems）中显示的一个代表性核微卫星色谱图（Ocp6）8。上方色谱图是通过扩增肝组织DNA获得的，在该位点为杂合子（354/358）。下方色谱图代表另一个个体，其基于从毛发中提取的DNA在该位点表现为杂合基因型（358/362）。尽管毛发样本色谱图的信号强度低于肝组织样本，但这种信号差异并未对基因型判读造成不利影响。
图 4. 在 Genemapper v3.7（Applied Biosystems）中显示的一个代表性 AFLP 色谱图（E31T32）。上方的色谱图是通过扩增肝脏组织中的 DNA 获得的，下方的色谱图代表从毛发中提取的 DNA。
图5. 在Sequencher v4.7软件（Gene Code Corporation）中显示的代表性线粒体DNA序列色谱图（细胞色素B）。上方色谱图通过扩增肝组织DNA获得，下方色谱图代表从毛发中提取的DNA。
图6. 对肝脏和毛发样本扩增的代表性分子性别鉴定标记（ZFX/ZFY）。该方法基于以下观察：Y染色体在此区域含有一个HinfI限制性酶切位点，而X染色体缺乏该位点。因此，雌性产生两条共迁移的432 bp片段，而雄性则产生432 bp、261 bp和171 bp的片段。
讨论
非侵入性遗传取样已成为传统活体捕获方法的一种颇具吸引力的替代方案，原因如下。首先，通过从野生种群中无干扰地收集生物样本（例如粪便、毛发、羽毛、唾液和黏液），研究人员可以在不干扰、不接触甚至不直接观察动物的情况下对其进行研究，从而降低对动物和研究人员双方的风险。其次，非侵入性遗传取样使生物学家能够研究那些行踪隐秘或稀有物种的种群，而使用传统的活体捕获方法往往难以实现这一目标6。第三，非侵入性遗传取样（NGS）有可能通过减少对动物的干扰、降低取样工作量和成本，从而增加样本量，有助于减少种群参数估计中的偏差7。当涉及濒危物种时，这一点尤为重要，因为种群参数的偏差估计可能导致不恰当的管理决策。
在本视频文章中，我们以美洲鼠兔为例，介绍一种简单、新颖、经济且非侵入性的方法，用于采集难以捕捉的小型哺乳动物样本。我们证明，从毛发中提取的DNA在微卫星、AFLP、线粒体和性别鉴定标记方面的表现与从肝脏样本中提取的DNA相当，这使得这种非侵入性采样方法成为活体捕获或致死采样的一种理想替代方案。总体而言，我们预计该方法将在稀有或难以捕捉的小型哺乳动物物种的种群遗传学和行为学研究的数据采集阶段发挥重要作用，同时最大限度地减少对研究对象的影响。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
我们感谢 L. Evans、B. Granger、D. Rissling、Z. Sim、A. Goodwin、K. Hayhurst 和 D. Kuch 在野外工作中的协助。K. Galbreath 慷慨提供了来自贝拉库拉山谷的鼠兔肝脏样本。感谢 A. Gonçalves da Silva 和 K. Larsen 富有启发性的讨论，这些讨论有助于本项非侵入性遗传取样方法的设计。本研究由加拿大自然科学与工程研究理事会发现基金以及 MAR 获得的英属哥伦比亚大学奥肯那根分校个人研究基金资助。PH 得到了瑞士国家科学基金会博士后奖学金（PBSKP3_128523）的支持。本研究遵循英属哥伦比亚大学的动物护理方案（证书编号：A07-0126）开展。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
毛发捕获器
DNA提取：
|
参考文献
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