最近的多项研究已发现与脑部病理相关的突触蛋白存在突变。原代培养的皮层神经元为研究这些致病相关蛋白对树突棘形态和运动性的影响提供了极大的灵活性。
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本文内容
摘要
摘要
树突棘是大脑中大多数兴奋性连接的发生部位，并构成突触的突触后区室。这些结构富含肌动蛋白，且已被证明具有高度动态性。在经典的赫布可塑性以及神经调节信号的作用下，树突棘可发生形态和数量的改变，这被认为对神经环路的精细化以及大脑中信息的处理与存储至关重要。在树突棘内部，一个复杂的蛋白质网络将细胞外信号与肌动蛋白细胞骨架相连，从而调控树突棘的形态和数量。神经病理学研究显示，多种疾病状态，从精神分裂症到自闭症谱系障碍，均表现出树突棘形态或数量的异常。此外，近期的遗传学研究已鉴定出多个编码突触蛋白的基因突变，提示这些蛋白可能参与异常的树突棘可塑性，从而部分地构成了这些疾病的病理生理基础。为了研究这些蛋白在调控树突棘形态/数量中的潜在作用，培养皮层神经元具有多项优势。首先，该系统可用于对固定细胞中的树突棘进行高分辨率成像，也可对活细胞进行时间序列成像。其次，这种体外系统可通过表达突变蛋白、利用shRNA载体进行基因敲降，或施加药理学处理，从而便捷地调控蛋白功能。这些技术手段使研究人员得以初步解析疾病相关蛋白的作用，并预测这些蛋白的突变可能产生的功能影响。 关键词：树突棘，突触，肌动蛋白细胞骨架，可塑性，皮层神经元，神经发育障碍，突触蛋白，基因突变，体外培养，时间序列成像 体内.
方案
本文所述方案可用于研究任何原代培养系统中的树突棘形态学及其动态变化。
1. 原代皮层神经元培养物的制备
- 从 Sprague-Dawley 大鼠 E18 胚胎制备高密度皮层神经元培养物，并在胶质细胞条件化无血清培养基中进行培养1-2.
- 根据ACUC规程处死一只妊娠大鼠（E18）；迅速取出子宫（含胚胎），置于冰上盛有100 mm培养皿中。
- 剪开子宫和羊膜，用一把镊子夹住胎儿颈部（保持脐带完整），另一把镊子从后向前剥离头皮，再用尖头镊子沿正中线从后向前剪开颅骨。
- 用弯头镊子（以舀取的方式）取出整个大脑，置于含有10 ml 冰冷 Ca2++- 和 Mg2无-+ 的 HBSS。
- 用一把镊子夹住脑干，用另一把镊子分离大脑半球，取出海马和纹状体，分离皮层并小心地将皮层组织从脑膜上剥离。
- 汇集解剖所得的皮层组织，短暂剪碎后转移至含有4 ml预热的胰蛋白酶/EDTA（0.25%胰蛋白酶，0.53 mM EDTA；HyClone SH30042.01 HyQ Trypsin）的15 ml离心管中；于37°C孵育 37 °C 水浴约15分钟；用一次性塑料移液管尽可能吸除胰蛋白酶/EDTA，加入1.5 ml神经元培养基。
- 通过5 ml移液器轻柔吹打消化后的组织进行机械解离（约10次，避免产生气....
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讨论
上述技术针对固定或活体原代皮质神经元中的树突棘形态、线性密度及动态性的详细定量分析，旨在深入理解可能参与神经病理过程的突触后机制。类似方法也可用于定量分析任何多棘神经元中的树突棘形态或动态性，包括海马锥体神经元、浦肯野细胞以及中等多棘神经元。
本文所述方案可适用于研究突触蛋白的基本特性，以及药物处理对树突棘的影响。此外，该方案还可用于评估内源性突触蛋白定位的变化，范围涵盖从支架蛋白到谷氨酸受体的各类蛋白。同时，该方法不仅能够对固定后的树突棘进行详细的形态计量学分析，还能测量突触蛋白或药物处理对树突棘运动性的影响。这些时间推移成像技术还可进一步改进，用于研究蛋白质的转运过程，且可选择性地同时观察树突棘的形态变化。
对树突棘形态和运动性的详细分析是研究突变型突触蛋白潜在影响的重要工具，有助于了解这些与疾病相关的突触蛋白发生突变后如何影响突触的结构与功能，从而揭示多种脑部疾病的病理生理机制。
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披露
本作品的制作得到了 MetaMorph（Molecular Devices, Inc.）的支持。
致谢
感谢 Kelly Jones 的细致编辑。本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 R01MH 071316、阿尔茨海默病协会、国家精神分裂症与抑郁症研究联盟（NARSAD）、国家自闭症研究联盟（NAAR）（P.P.）；美国心脏协会博士后奖学金（D.P.S.）；美国心脏协会博士前奖学金（K.M.W.）提供支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 18 mm 圆形盖玻片，1.5 号 | Warner Instruments | 64-0714 (CS-18R15) | |
| 22 mm 方形盖玻片，1.5 号 | Warner Instruments | 64-0721 (CS-22S15) | |
| 聚-D-赖氨酸 | Sigma-Aldrich | P-0899 | 分子量 70~150 Kda |
| Neurobasal 培养基 | Invitrogen | 21103049 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| 谷氨酰胺 | Invitrogen | 21051024 | |
| 青霉素-链霉素 | Invitrogen | 15140148 | |
| D,L-APV (AP-5) | Ascent Scientific | Asc-004 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| DMEM | Invitrogen | 11965092 | |
| HEPES | Mediatech, Inc. | 25-060-C 1 | 1M，pH 7 |
| 甲醛溶液 | EMD Millipore | FX0415-5 | 36%，组织学级 |
| 正常山羊血清 | VWR international | 100188-514 | Jackson Immunoresearch Labs |
| 吐温 X-100 | Fisher Scientific | AC21568-2500 | Acros Organics |
| Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG (H+L)，高度交叉吸附 | Invitrogen | A-11029 | |
| Alexa Fluor 488 山羊抗兔 IgG (H+L)，*高度交叉吸附* | Invitrogen | A-11034 | |
| ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂 | Invitrogen | P36934 | 特殊包装 |
| 封闭式成像载台腔室 | Warner Instruments | RC-30HV | |
| 温度控制单元 | Warner Instruments | TC-344B | |
| MetaMorph | Universal Imaging |
参考文献
- Banker, G., Goslin, K. Developments in neuronal cell culture. Nature. 336, 185-186 (1988).
- Xie, Z. Kalirin-7 controls activity-dependent structural and functional plasticity of dendritic spines. Neuron. 56, 640-656 (2007).
- Spear, L.
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重印与许可
