培养的中枢神经系统神经元中树突棘形态的分析

摘要

最近的多项研究已发现与脑部病理相关的突触蛋白存在突变。原代培养的皮层神经元为研究这些致病相关蛋白对树突棘形态和运动性的影响提供了极大的灵活性。

摘要

树突棘是大脑中大多数兴奋性连接的发生部位，并构成突触的突触后区室。这些结构富含肌动蛋白，且已被证明具有高度动态性。在经典的赫布可塑性以及神经调节信号的作用下，树突棘可发生形态和数量的改变，这被认为对神经环路的精细化以及大脑中信息的处理与存储至关重要。在树突棘内部，一个复杂的蛋白质网络将细胞外信号与肌动蛋白细胞骨架相连，从而调控树突棘的形态和数量。神经病理学研究显示，多种疾病状态，从精神分裂症到自闭症谱系障碍，均表现出树突棘形态或数量的异常。此外，近期的遗传学研究已鉴定出多个编码突触蛋白的基因突变，提示这些蛋白可能参与异常的树突棘可塑性，从而部分地构成了这些疾病的病理生理基础。为了研究这些蛋白在调控树突棘形态/数量中的潜在作用，培养皮层神经元具有多项优势。首先，该系统可用于对固定细胞中的树突棘进行高分辨率成像，也可对活细胞进行时间序列成像。其次，这种体外系统可通过表达突变蛋白、利用shRNA载体进行基因敲降，或施加药理学处理，从而便捷地调控蛋白功能。这些技术手段使研究人员得以初步解析疾病相关蛋白的作用，并预测这些蛋白的突变可能产生的功能影响。 关键词：树突棘，突触，肌动蛋白细胞骨架，可塑性，皮层神经元，神经发育障碍，突触蛋白，基因突变，体外培养，时间序列成像 体内.

方案

本文所述方案可用于研究任何原代培养系统中的树突棘形态学及其动态变化。

1. 原代皮层神经元培养物的制备

1. 从 Sprague-Dawley 大鼠 E18 胚胎制备高密度皮层神经元培养物，并在胶质细胞条件化无血清培养基中进行培养^1-2.
2. 根据ACUC规程处死一只妊娠大鼠（E18）；迅速取出子宫（含胚胎），置于冰上盛有100 mm培养皿中。
3. 剪开子宫和羊膜，用一把镊子夹住胎儿颈部（保持脐带完整），另一把镊子从后向前剥离头皮，再用尖头镊子沿正中线从后向前剪开颅骨。
4. 用弯头镊子（以舀取的方式）取出整个大脑，置于含有10 ml 冰冷 Ca2+⁺- 和 Mg²无-+ 的 HBSS。
5. 用一把镊子夹住脑干，用另一把镊子分离大脑半球，取出海马和纹状体，分离皮层并小心地将皮层组织从脑膜上剥离。
6. 汇集解剖所得的皮层组织，短暂剪碎后转移至含有4 ml预热的胰蛋白酶/EDTA（0.25%胰蛋白酶，0.53 mM EDTA；HyClone SH30042.01 HyQ Trypsin）的15 ml离心管中；于37°C孵育 37 °C 水浴约15分钟；用一次性塑料移液管尽可能吸除胰蛋白酶/EDTA，加入1.5 ml神经元培养基。
7. 通过5 ml移液器轻柔吹打消化后的组织进行机械解离（约10次，避免产生气泡），加入2 ml培养基，静置30秒，然后将2 ml上清液转移至15 ml离心管中。
8. 重复步骤6两次（总共约需15分钟）。
9. 200 × g 离心 2 分钟。
10. 移去上清液（使用5 ml移液管——切勿用真空抽吸）；通过轻弹管底使沉淀松散；将细胞沉淀重悬于5 ml培养基中，并通过滤器过滤 40 μm 细胞滤筛放入50 ml离心管中。
11. 混合 10 μl 细胞悬液和 10 μl 台盼蓝；使用血细胞计数板通过台盼蓝排斥法计数活细胞。
12. 典型产量：5 x 10⁶ 细胞/脑组织；稀释至所需密度（例如 1.5 x 10⁶ 细胞/毫升）用于铺板。
13. 用铺板培养基（Neurobasal 培养基添加 2% B27、0.5 mM 谷氨酰胺和 1% 青霉素:链霉素）填充培养板（总体积 负 含18 mm圆形或22×22 mm方形盖玻片的培养板（涂有聚-D-赖氨酸（0.2 mg/ml，Sigma），溶于0.1 M硼酸盐缓冲液（3.1 g/L硼酸，4.8 g/L硼砂，pH 8.5，过滤除菌））；12孔板每孔总体积为0.8 ml。
14. 以下一步提供的密度接种神经元；通过轻轻摇晃或轻敲使细胞均匀分散。
15. 对于12孔板（3.5 cm）²/孔）：（高密度 3 × 10⁵/well=857/mm²）（中等密度 1.5 x 10⁵/well=430/mm²）； 6 孔板（9.6 cm²/孔）：（高密度 9 x 10⁵/well=624/mm²）（中密度 4.5 × 10⁵/well=312/mm²).
16. 铺板后1小时，将全部培养基更换为新鲜培养基（Neurobasal培养基添加2% B27、0.5 mM谷氨酰胺和1%青霉素:链霉素）。由于细胞碎片容易沉积在孔板中央，更换前应先轻轻旋转培养板以利于碎片去除；操作过程中需注意避免细胞干燥。
17. 此后每周更换½培养基两次（每次移除约300-350 μl 从每个孔中取出，并加入 400 μl 将预热的新鲜培养基加入每孔。
    可选：在 DIV 4 时添加 200 μM D,L-氨基磷酰戊酸（D,L-APV，Ascent Scientific）加入培养基中；在添加了2% B27、0.5 mM 谷氨酰胺和1% 青霉素:链霉素的Neurobasal培养基中培养神经元 + 200 μM APV
18. 培养皮层神经元原代细胞 24 至 28 天 体外 （体外培养天数），因为此时树突棘已呈现成熟形态（即已与突触前伙伴形成连接，并具有明显的头状结构），在啮齿类动物中相当于青春期早期^3-4在18 mm圆形盖玻片上培养的神经元可在转染并进行药理学处理后，经固定、免疫染色，使用共聚焦显微镜成像，用于树突棘的详细形态学分析。在22×22 mm方形盖玻片上培养的细胞则可用于延时成像实验，以研究树突棘的动态变化。

2. 原代培养皮层神经元的转染

1. 实验前2-3天，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）转染皮层神经元⁵.
2. 通过使用10 mM无菌HEPES平衡DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基；不含谷氨酰胺，Invitrogen 11965-092）的pH值来制备“h-DMEM”4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸 MediaTech Cellgro 25-060-C I，1 M，pH 7）。置于37°C水浴中预热至 37°C.
3. 将盖玻片转移至 600/1000 μl （18/22×22 mm 盖玻片）预热（37°C无抗生素新培养基（Neurobasal 培养基、B27、0.5 mM 谷氨酰胺），并将细胞置于湿润环境中培养 37°C 培养箱，补充5% CO₂ 30 分钟。
4. 每个盖玻片中加入指定量的DNA（一种或多种DNA质粒，例如pEGFP用于标记细胞形态，以及带标签的突变型突触蛋白；1-2 μg 取决于构建体）到 50 μl 加入h-DMEM；静置5分钟。
5. 每个盖玻片加入4/6 μl (18/22×22 mm 盖玻片) Lipofectamine 2000 转染试剂 50 μl h-DMEM；静置5分钟。
6. 充分混匀第1.3步中的试管&1.4，在湿润环境中孵育至少20分钟 37°C 培养箱，补充5% CO₂复合物在6小时内保持稳定，具体以制造商说明为准。
7. 将步骤1.5中的Lipofectamine 2000/DNA混合物逐滴加入细胞中。将细胞置于湿润环境中孵育 37°C 孵育箱中，补充5% CO2，孵育4小时。
8. 使用步骤1.1中的培养基（300/600 μl），加入预热的（37°C) 400/800 μl 新鲜培养基（18/22×22 mm 盖玻片）。在完成步骤 1.6 后，将盖玻片转移至含有旧培养基和新鲜培养基的培养液中。
9. 让质粒表达持续 2-3 天。

3. 在18 mm盖玻片上培养的原代皮层神经元的处理

先前已转染的神经元接种于18 mm盖玻片上，也可轻松进行药物处理。

1. 配制人工脑脊液（ACSF，单位为 mM：125 NaCl、2.5 KCl、26.2 NaHCO₃、1 NaH₂PO₄、11 葡萄糖、5 HEPES、2.5 CaCl₂ 和 1.25 MgCl₂，加入 200 μM D,L-APV）。将 ACSF 预热至 37°C。将盖玻片置于 900 μl 温热的 ACSF 中预孵育 30–60 分钟。此期间可进行抑制剂的预处理。
2. 从储备液中配制药物/溶剂至 10X 工作浓度；用 ACSF 对溶液进行稀释。小心地将药物/溶剂加入细胞中（终体积为 1000 μl，药物/溶剂终浓度为 1X），并按照所需时间进行处理⁵。
3. 处理结束后，固定细胞并进行免疫细胞化学染色。

4. 固定与免疫细胞化学（ICC）

1. 将神经元固定于4%多聚甲醛/4%蔗糖PBS溶液（800 μl）中，室温孵育20分钟；或先在相同溶液（800 μl）中室温固定10分钟，经PBS洗涤2次后，再加入预冷（-20°C）甲醇（800 μl）于4°C下固定10分钟。甲醇固定通过使蛋白质变性并沉淀实现，该步骤可暴露突触后密度区（PSD）以及富含脂质区域中的蛋白质。
2. 用PBS（800 μl）洗涤盖玻片，共2次，每次10分钟。
3. 在含2%正常山羊血清和0.1% Triton-X-100的PBS（800 μl）中，室温下同时进行细胞通透化与封闭，持续1小时。
4. 将针对GFP、表位标签（如His、myc、V5）或内源性蛋白的一抗按适当浓度加入含2%正常山羊血清的PBS中。取一个15 cm培养皿，划分成若干方格并编号，表面覆盖Parafilm膜。每格滴加约80 μl抗体与封闭液混合物（每格一滴），将盖玻片细胞面向下放置于抗体/封闭混合液上，4°C孵育过夜。
5. 用PBS洗涤盖玻片，共3次，每次15分钟。
6. 将Alexa荧光标记的二抗（Invitrogen）按适当浓度稀释于含2%正常山羊血清的PBS中。与步骤4相同方式孵育二抗，室温避光孵育1小时。
7. 进一步用PBS洗涤盖玻片3次，每次15分钟。
8. 使用ProLong Gold抗荧光淬灭封片剂（Invitrogen）将盖玻片封固于标准显微镜载玻片上。

5. 树突棘形态的定量分析

我们使用蔡司 LSM5 Pascal 共聚焦显微镜获取单标记和双标记神经元（表达 GFP 以及外源构建体或内源目的蛋白的细胞）的共聚焦图像。在所有成像实验中，应选择健康的锥体神经元进行成像并用于后续分析。健康的神经元是指未表现出任何因处理或固定导致的出芽现象或应激迹象，并具有完整且连续树突分支的细胞。

1. 使用数值孔径（NA）为1.4的63倍油浸物镜（Zeiss），以Z轴序列采集3–8张图像，每张图像平均4次，Z轴步距为0.37 μm，分辨率为1024×1024像素，扫描速度为每截面2.5秒，获取神经元图像。需要直接比较的培养样本必须使用相同的成像参数进行采集。每个实验条件应分析10–20个神经元，每个神经元选取2条长度为100 μm的树突，且来自3–5个独立实验。实验应在盲法条件下对姊妹培养物进行。调整探测器增益和偏移，使即使荧光较弱的细长树突棘也能被纳入，同时避免树突周围出现光晕，确保树突棘荧光信号与背景之间的过渡清晰，以实现精确量化。同一实验内所有扫描的成像参数应保持一致。
2. 绿色荧光蛋白（GFP）图像可使用氩离子激光（激发波长488 nm）激发，并通过505–530 nm带通滤光片采集。过表达蛋白或经Alexa 568二抗（Invitrogen）免疫染色的内源蛋白图像，可使用HeNe激光（激发波长543 nm）激发，并通过560 nm长通滤光片采集。激光功率应保持在最低水平，以避免样本发生光漂白。
3. 使用MetaMorph软件（Molecular Devices, Inc.）对Z轴序列图像进行二维背景扣除，并生成最大投影重建图像，用于形态学分析与量化。为观察树突棘的形态，需将Z轴序列图像合并，校准所需距离，然后设定阈值，使所有树突棘均被包含，且阈值恰好与树突棘轮廓一致（图2E,F）。为减少变异性，仅测量二级和三级树突上的树突棘（每神经元总长度100 μm），且测量段应位于分支点之间。手动勾画每个树突棘，使其形成闭合轮廓（图2G）。
4. 在MetaMorph中自动测量以下树突棘参数：树突棘长度、树突棘宽度、横截面积以及树突棘线性密度。将树突棘形态学参数导出至Excel进行量化分析。使用非配对Student t检验确定两组间差异的统计学显著性；对于三组及以上的比较，可采用单因素方差分析（one-way ANOVA），随后进行Tukey-b事后检验（post hoc）进行多重比较。统计分析可在Excel、GraphPad或SPSS中完成。使用Kolmogorov-Smirnov检验（K-S检验）^2,5-6分析累积分布图。

6. 定量免疫荧光（IF）

使用针对特定突触蛋白的抗体进行免疫荧光染色，并通过Alexa 568二抗（Invitrogen）可视化，可用来检测内源性突触蛋白在簇集及突触定位上的变化。

1. 按照上述方法使用共聚焦显微镜采集图像。采用氩离子激光器和氦氖激光器（见上文）对双标神经元进行成像。仅对未显示任何应激迹象的健康锥体神经元进行成像。
2. 进行荧光强度测量时，使用 MetaMorph 软件减去对应于树突主干的背景信号（图 2I，黄色方框），生成“背景扣除后”的图像（图 2J）。对图像进行统一阈值处理，以包含荧光强度至少为相邻树突两倍以上的聚集体（图 2K）。使用“Perimeters”工具沿树突划定区域（每神经元 100 μm）（图 2D），并利用 MetaMorph 自动测量每个突触聚集体的线密度（个/100 μm 树突长度）和整合荧光强度（总 IF 强度）^7-9。
3. 为测量突触蛋白在树突棘中的相对含量，首先通过阈值分割 GFP 图像以确定树突棘形态（图 2E,F），使用 MetaMorph 完成该步骤。将仅包含树突棘的感兴趣区域转移至另一通道中目标蛋白的图像上（图 2G,H）。统计蛋白聚集体的数量，并测量树突棘内免疫荧光整合强度，以评估树突棘中该蛋白的含量。
4. 将突触蛋白的免疫荧光参数导出至 Excel 进行定量分析。使用非配对 Student t 检验确定两组间差异的统计学显著性；采用单因素方差分析（one-way ANOVA）比较三组或更多组之间的差异，并随后进行 Tukey-b post hoc 多重比较检验。统计分析可在 Excel、GraphPad 或 SPSS 中完成。

7. 时间序列成像

为了研究树突棘动态（例如单个树突棘的运动性或形态学变化）以及在疾病相关突触蛋白存在或缺失条件下的变化，将原代皮层神经元培养于22×22 mm的方形盖玻片上，培养至24–28天（DIV）。神经元可共转染GFP/mCherry以标记细胞形态，并共转染上述方法描述的荧光标记突变突触蛋白。在所有成像实验中，应选择健康且同时表达两种构建体的锥体神经元；这些细胞可用于药物处理、成像分析及后续实验研究。

1. 将生长在22×22 mm盖玻片上的神经元置于1.5 ml ACSF中，在加湿的37°C培养箱中预孵育30-60分钟，并补充5% CO₂。此阶段也可对细胞进行药物预处理。预孵育/处理结束后，将细胞转移至封闭式成像载物台腔室（Warner, RC-30HV）中，并使用控温装置（Warner, TC-344B）维持37°C的温度^2,5-6,10。
2. 为观察树突棘运动性，可在转移细胞至成像腔室前30-60分钟用药物或溶剂对照进行预处理。这有助于药物或溶剂有足够时间激活神经元内的第二信使通路。通过63X物镜（Ziess, N.A. 1.4）以2倍平均扫描，每隔10分钟采集一次图像。选择形态健康、整体呈锥体状且表达GFP/mCherry或荧光标记蛋白的神经元。为减少光损伤，将激光功率降低至0.5-1%。通过比较溶剂对照处理组与药物处理组的细胞，可揭示树突棘运动性的变化。或者，也可在灌注药物/溶剂前后（见下文）分别评估树突棘运动性。每个时间点均需采集Z轴层扫图像（Z-stacks）。
3. 为追踪树突棘形态随时间的变化，先对盖玻片进行1小时的成像以建立形态学基线变化。随后，使用蠕动泵（Gilson, Minipuls 3）将药物/溶剂灌注到成像腔室中，并继续对神经元成像1小时。使用63X油镜（Ziess, N.A. 1.4）采集共聚焦Z轴层扫图像，每10分钟采集一次，每次进行2倍平均扫描。为最小化光损伤，将激光功率降低至0.5-1%。
4. 每次成像结束后，获取整个神经元的20X图像以评估光损伤程度。任何表现出应激迹象的神经元均应从定量分析中剔除。各时间点的Z轴层扫图像应在Metamorph软件中合并为二维投影图像。根据图像质量和转染水平，可在Metamorph中应用中值滤波或背景扣除，以获得清晰的分析图像。
5. 为评估树突棘形态变化和运动性，应对100分钟成像过程的起始、中期和结束时采集的图像在MetaMorph软件中进行颜色编码并叠加。每细胞需分析至少100 μm长度的树突。总树突棘运动分数定义为运动事件总数（即延伸、回缩、头部形态改变或突起运动）除以树突棘总数并归一化^6,11。该方法仅测量事件发生的频率，不考虑其幅度；将所有类型的事件合并统计，作为整体运动性的通用估计值。突起事件定义为从树突棘头部或树突干上出现新的短暂突起；回缩事件定义为已有或短暂存在的突起从树突棘头部或树突干上消失。突起与延伸事件的总和除以所定量树突区域内的总树突棘数量。
6. 为评估药物处理对单个树突棘形态的影响，需测量给药前-1小时（灌注前1小时）、处理前即刻以及每次处理后各时间点的树突棘横截面积或树突棘线密度。将各时间点数据归一化至处理前1小时的时间点。为确认树突棘形态或线密度的变化并非由光损伤引起，应对仅灌注溶剂对照的神经元进行分析。均值差异可通过Student非配对t检验或单样本t检验确定。

8. 替代方法与成功关键

1. 我们已描述了在 D,L-APV（一种 NMDA 受体抑制剂）存在下培养皮层神经元，从体外培养第 4 天（DIV 4）直至成熟（DIV 24–28）。需要注意的是，尽管在 D,L-APV 存在下培养皮层神经元有利于长期维持皮层神经元培养物的良好状态，但 D,L-APV 的存在可能影响突触的发育。因此，另一种选择是在无 D,L-APV 的条件下培养神经元。^2,5在无D,L-APV条件下培养神经元时，应格外关注培养物的整体健康状况，因为NMDA受体过度激活可能导致细胞内Ca2+浓度过高，从而增加钙离子细胞毒性及细胞死亡的风险。
2. 本方案中所述的神经元培养可用于研究与成熟形态树突棘（即已与突触前伙伴形成连接，并具有明显头状结构的树突棘）的形态调控及运动性相关的作用机制2,4,5。 alternatively，使用更早期的培养物（例如DIV11-16）可能更适合研究树突棘形成相关问题，或早期发育过程中树突棘的调控机制。
3. 使用共聚焦显微镜的一种替代方法是采用宽场落射荧光显微技术，对经处理的培养皮层神经元进行成像。结合适当的去卷积算法，可在固定或活细胞中对树突棘进行详细的形态计量分析。此外，还可使用其他软件，如 ImageJ（http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html）或 Neuronstudio（http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html）这些是用于分析树突棘形态的自由软件。
4. 在使用延时成像技术观察树突棘的运动性或形态变化时，应注意采用较短的延时时间间隔（例如5-10分钟）可对树突棘的更新提供更为详尽的分析2,5。较短的时间间隔还有可能识别出快速的树突棘形态变化，而这些变化在较长的时间间隔下可能无法被检测到。
5. 使用培养的皮层神经元存在若干不利因素和需要注意的问题。首先，使用培养的皮层神经元的一个顾虑是不同培养批次之间可能存在差异，从而影响树突棘密度等参数。因此，必须严格遵守以下要点，以最大程度减少变异。首先，除良好的培养操作外，培养条件和试剂应尽可能保持一致，这将显著降低不同培养批次之间的变异程度。其次，所有实验必须在同一时间点进行，并使用同一批次的姐妹培养物。此外，实验进行的时间点应仔细选择，以便研究者能够提出合适的研究问题（参见上述第2点）。最后，所有实验中必须使用适当的对照，使处理条件始终相对于这些内部对照进行评估。这将消除不同培养批次间可能存在的变异顾虑。
6. 使用培养的皮层神经元是研究者深入探究调控树突棘形态与运动关键机制的有力工具。然而，需要注意的是，这些培养物并不能完全重现 体内 然而，上述系统无法研究皮层分层结构等组织情况，以及其他细胞类型（如胶质细胞）对突触形成的效应。尽管如此，该系统可用于识别调控树突棘形态与运动性的潜在关键机制。

9. 代表性结果

上述实验旨在研究树突棘在体外经药物处理和/或对蛋白质功能进行遗传学操控后，其形态、数量和运动性的变化。在本实验室中，我们已利用这些技术来表征调控树突棘中肌动蛋白细胞骨架的突触蛋白，从而改变其结构^2,9。此外，我们还应用该实验来确定神经活性化合物（如神经调质）单独^4,6,10，或在依赖活动性刺激存在的情况下⁵，如何驱动树突棘的形态、数量或形状发生变化。

为了评估我们对一维或二维参数测量的准确性，我们在与神经元相同的研究条件下，测量了已知尺寸（0.2、0.52、1.0 μm）的荧光乳胶微球（Duke Scientific）的直径和面积。使用与树突棘测量相同的成像条件（63X NA=1.4 油浸物镜，LSM 5 Pascal），对微球进行成像，然后在 Metamorph 软件中以类似于树突棘测量的方法测定其直径和面积。随后，我们将实测值与微球的已知尺寸进行比较。

图1（Fig.1）中的曲线显示，我们能够准确测量直径为0.52和 1.0 μm （区域 = 0.21 μm² 和 0.78 μm² 分别）（测量标准差约15%；制造商测定标准差约9%）。即使对于 0.2 μm 微球的测量值与实际尺寸相当接近（但标准差较大）。这与使用该物镜时共聚焦显微镜计算得到的横向分辨率相符。 0.3 μm （使用公式 Δxcf = (0.61/v²)√/NA）¹²这明显优于轴向分辨率，而轴向分辨率已知在共聚焦和双光子显微镜中表现较差。此外，我们通过测量直径为200 nm的绿色荧光微球（Duke Scientific）实验确定了横向（x/y轴）点扩散函数（PSF），其值约为 0.5 μm此估算在针孔打开的情况下进行，因此可以推断，当针孔关闭时，点扩散函数（PSF）实际上会更小。尽管如此，这再次表明我们能够准确测量大于 0.196 μm² （直径 = 0.5 μm）。实际横向点扩散函数（PSF）的指示见于（Svoboda 等）13 作为“不少于 0.4 μm，这将导致一个区域 0.16 μm²这些比较和理论分析表明，我们可以准确测量与树突棘尺寸相近的物体，因为我们所测量的树突棘尺寸大于该分辨率极限> 0.25 μm²）。对于此类条件，“经典的形态测量技术是定量的"¹³，表明我们可以可靠地测量树突棘面积，并在不同处理条件下准确比较树突棘形态。

为了准确测量树突棘的形态，我们对体外培养23天的大脑皮层神经元转染EGFP质粒，持续2天。 转染后，细胞可进行相应处理，随后固定并进行免疫细胞化学染色，以增强GFP信号，使其在树突（或神经元）中分布均匀。 图2显示了转染GFP的大脑皮层神经元的代表性图像，该图像使用共聚焦显微镜配合63倍物镜（数值孔径1.4）采集（图2A）。 这种方法可以获得树突棘的高分辨率详细图像（图2B）。 在本实验室中，我们使用Metamorph软件对树突棘进行详细的形态计量分析。 该软件不仅可用于测量树突棘的形态，还可用于检测内源性蛋白的定位。 图2（图2C-G）概述了我们执行该分析的具体流程。

活动依赖性刺激的一个特征性效应是树突棘尺寸增大²。图3展示了表达EGFP的体外培养24天（DIV 24）皮层神经元的树突棘在活动依赖性刺激前后各30分钟的代表性延时成像结果。该延时成像实验证实，活动依赖性刺激可增加树突棘的尺寸（图3A,B）。为检测基础状态下的树突棘动态，分别在0、50和100分钟时间点采集图像，并分别测量树突棘的延伸、回缩、突出运动及头部形态变化，再将其合并为总动态性。图3C-D证实，即使在基础条件下，皮层神经元的树突棘仍表现出一定程度的动态性。

图 1. 荧光微球测量面积与实际面积的比较。 误差线表示测量面积的标准偏差。图像分别为 0.2 μm、0.52 μm 和 1 μm 的微球。比例尺 = 5 μm。

图 2. 树突棘形态学及免疫荧光（IF）的定量分析。 A. 表达EGFP的体外培养皮层神经元（DIV 25）图像。B. 皮层神经元上典型树突棘形态的高倍放大图像。C. EGFP与内源性蛋白（GluR1）信号叠加图。D. EGFP转染的锥体细胞树突的Z轴层扫图像合并投影；主干与树突棘之间的分界通过手动勾画。E. Metamorph软件随后对明显且高于阈值的区域进行轮廓描记并定量分析。F. 手动描记的神经元用于测定树突棘的长度、宽度和横截面积。G. 由Metamorph软件识别并定义为树突棘的区域。H. 将树突棘轮廓转移至红色通道图像（内源性蛋白信号），以定量分析树突棘特异性信号强度。I-K. 为定量受体或突触蛋白簇的免疫荧光（IF）信号，采用Z轴层扫图像的投影图。I. 扣除树突主干背景荧光信号（黄色方框区域），生成“背景扣除后”图像。J. 对该图像进行阈值设定，程序自动测量蛋白簇的面积、线密度和总灰度值（IF强度）。K. 来自H图的阈值处理图像。比例尺：A = 15 μm，B = 1 μm。

图3. 树突棘形态的活动依赖性变化及其基础运动性。A. 活动依赖性刺激添加前后代表性树突棘的时间推移成像。通过将实验培养基从含有 Mg²⁺ 的 ASCF 切换至不含 Mg²⁺ 的 ASCF，诱导产生活动依赖性刺激。⁺ 以及将APV加入无Mg2+且不含APV但含有 10 μm 甘氨酸 B. 树突棘面积（大小）的量化，以灌注前-30分钟时间点为标准化参照。 C. 树突棘运动的代表性图像，时间点分别为 0、50 和 100 分钟。上方图像显示 0 分钟（红色）、50 分钟（绿色）和 100 分钟（蓝色）的叠加结果，下方图像则分别为各时间点的单独图像。星号标记棘突延伸；白色箭头标记棘突回缩；绿色箭头头标记突出运动；空心黄色箭头头标记棘头形态变化。 D. 树突棘运动参数及总运动性的量化 E. 成像实验后用于评估细胞健康状态的表达EGFP的皮层神经元20倍图像

讨论

上述技术针对固定或活体原代皮质神经元中的树突棘形态、线性密度及动态性的详细定量分析，旨在深入理解可能参与神经病理过程的突触后机制。类似方法也可用于定量分析任何多棘神经元中的树突棘形态或动态性，包括海马锥体神经元、浦肯野细胞以及中等多棘神经元。

本文所述方案可适用于研究突触蛋白的基本特性，以及药物处理对树突棘的影响。此外，该方案还可用于评估内源性突触蛋白定位的变化，范围涵盖从支架蛋白到谷氨酸受体的各类蛋白。同时，该方法不仅能够对固定后的树突棘进行详细的形态计量学分析，还能测量突触蛋白或药物处理对树突棘运动性的影响。这些时间推移成像技术还可进一步改进，用于研究蛋白质的转运过程，且可选择性地同时观察树突棘的形态变化。

对树突棘形态和运动性的详细分析是研究突变型突触蛋白潜在影响的重要工具，有助于了解这些与疾病相关的突触蛋白发生突变后如何影响突触的结构与功能，从而揭示多种脑部疾病的病理生理机制。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
18 mm 圆形盖玻片，1.5 号	Warner Instruments	64-0714 (CS-18R15)
22 mm 方形盖玻片，1.5 号	Warner Instruments	64-0721 (CS-22S15)
聚-D-赖氨酸	Sigma-Aldrich	P-0899	分子量 70~150 Kda
Neurobasal 培养基	Invitrogen	21103049
B27	Invitrogen	17504044
谷氨酰胺	Invitrogen	21051024
青霉素-链霉素	Invitrogen	15140148
D,L-APV (AP-5)	Ascent Scientific	Asc-004
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668019
DMEM	Invitrogen	11965092
HEPES	Mediatech, Inc.	25-060-C 1	1M，pH 7
甲醛溶液	EMD Millipore	FX0415-5	36%，组织学级
正常山羊血清	VWR international	100188-514	Jackson Immunoresearch Labs
吐温 X-100	Fisher Scientific	AC21568-2500	Acros Organics
Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG (H+L)，高度交叉吸附	Invitrogen	A-11029
Alexa Fluor 488 山羊抗兔 IgG (H+L)，*高度交叉吸附*	Invitrogen	A-11034
ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂	Invitrogen	P36934	特殊包装
封闭式成像载台腔室	Warner Instruments	RC-30HV
温度控制单元	Warner Instruments	TC-344B
MetaMorph	Universal Imaging