介绍了一种新的无需树突状细胞的抗原特异性T细胞诱导与扩增方法。基于HLA A2-Ig的人工抗原呈递细胞（aAPC）可加载HLA-A2限制性多肽，从而高效扩增具有不同抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）。该技术在基于CTL的过继性免疫治疗中具有广阔的应用前景。
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摘要
摘要
具有最佳效应功能的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）在介导抵御多种胞内感染和癌症方面发挥着关键作用。然而，个体可能表现出抑制性免疫微环境，与其自身抗原提呈细胞激活CTL的作用相反，这些细胞更倾向于使抗原特异性CTL发生耐受或无能。因此，尽管仍处于实验阶段，基于CTL的过继性免疫治疗已发展成为治疗癌症和病毒感染等多种疾病的一种有前景的策略。在初期实验中 离体 扩增的巨细胞病毒（cytomegalovirus, CMV）特异性CTL已用于治疗免疫功能低下异基因骨髓移植患者中的CMV感染。尽管这些患者中出现危及生命的CMV病毒血症较为常见，但接受扩增CTL治疗的患者均未发生CMV相关疾病，表明通过过继转移的CTL可建立抗CMV免疫。1在黑色素瘤中也观察到了有希望的结果，并可能推广至其他类型的癌症2.
虽然有许多方法可以 离体 刺激和扩增人细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的现有方法受限于成本和技术局限。例如，当前的金标准依赖于使用自体树突状细胞（DC）。该方法要求每位患者捐献大量白细胞，且成本高昂、操作繁琐。此外，对体外扩增的DC来源CTL进行的详细表征表明，这些细胞仅具有次优的效应功能 3.
在此，我们介绍一种高效的基于aAPC的系统 离体 用于过继性免疫治疗的人巨细胞病毒特异性CTL扩增（图1）。aAPC通过将细胞大小的磁珠与人HLA-A2-Ig二聚体和抗CD28单克隆抗体偶联制备而成4制备好的人工抗原呈递细胞（aAPC）可加载多种感兴趣的肽段，并能保持数月的功能活性。本报告中，aAPC被加载了来自巨细胞病毒（CMV）的主要抗原肽pp65（NLVPMVATV）。在培养纯化的人源CD8⁺ T细胞后+ 来自健康供体的CTL与aAPC共培养一周后，CMV特异性CTL的特异性可显著提高至98%（图2），扩增倍数超过10,000倍。若需要更多CMV特异性CTL，可通过重复使用aAPC刺激实现进一步扩增。表型与功能特征分析显示，扩增后的细胞具有效应记忆性表型，并可产生大量TNFα和IFNγ（图3）。
方案
1. 制备基于 HLA-A2-Ig 的人工抗原呈递细胞（aAPC）
- 制备无菌硼酸盐缓冲液
- 将硼酸溶解于水中，配制成 0.1M 溶液，调节 pH 至 7.0。
- 经 0.22μm 无菌滤膜过滤后，于 4°C 保存。
- 制备无菌珠洗缓冲液
- 取 956ml 不含镁和钙的 PBS。
- 加入 30ml 人 AB 型血清。
- 加入 EDTA 至终浓度为 2mM。
- 加入 0.1g 叠氮化钠。
- 经 0.22 μm 无菌滤膜过滤后，于 4°C 保存。
- 从库存中取出 1ml Invitrogen M-450 环氧基磁珠，约含 4 亿个磁珠（可通过血细胞计数板计数），置于无菌螺口玻璃小瓶中。
- 将小瓶紧贴 Dynal 磁力架 MPC-1，待磁珠吸附至管壁一侧后，用移液器吸除上清液。用 1ml 硼酸盐缓冲液洗涤磁珠一次。
- 将磁珠重悬于 1ml 硼酸盐缓冲液与 20 μg HLA-A2-Ig 二聚体及 20 μg 抗人 CD28 单克隆抗体（克隆号 9.3）的混合液中。
- 蛋白与磁珠偶联：将玻璃小瓶置于旋转仪上，于 4°C 旋转孵育 24 小时。
- 将小管置于 MPC-1 磁力架中，完全去除硼酸盐缓冲液。
- 用 1ml 珠洗缓冲液洗涤磁珠两次。
- 将磁珠悬浮于 1ml 珠洗缓冲液中，于 4°C 旋转孵育 24 小时。由于珠洗缓冲液中含有人 AB 型血清，可封闭磁珠上所有残留的蛋白结合位点。
- 去除玻璃小瓶中的上清液，替换为 1ml 新鲜的珠洗缓冲液。
2. 可溶性人工抗原提呈细胞的质量控制及多肽负载、储存
- 在FACS管中，将约5×105个磁珠加入100μl FACS洗涤缓冲液，加入1μl抗小鼠IgG1-PE（识别HLA-A2-Ig的Fc段）和1μl抗小鼠IgG2a-FITC（识别抗CD28单克隆抗体的Fc段）。在FACS洗涤缓冲液中染色20分钟后，再次洗涤，并立即通过流式细胞仪读取染色结果（图4）。
- 肽段负载至磁珠：在玻璃小瓶中用1ml无菌PBS洗涤磁珠两次。重悬于1ml无菌PBS后，加入10μl CMV肽段（1mg/ml）。
- 使用血细胞计数板计数磁珠，并在小瓶上标注日期和浓度。
- 人工抗原呈递细胞（aAPC）需在4°C下与肽段孵育至少3天，以确保肽段充分结合至HLA-A2-Ig二聚体，此后即可使用。磁珠可在4°C保存，且至少6个月内保持功能活性。
3. 人CTL的分离
- 从健康的 HLA-A2 阳性供体采集约 100 ml 新鲜外周血至 10 支 BD 肝素钠真空采血管中。使用 21 号或更大规格的针头，以防止溶血。
- 在室温下以 300×g 离心 10 分钟。
- 小心吸除上层血浆层。该血浆可用作培养基的补充成分。
- 用无菌 PBS 替代采集的血浆，并将血液转移至无菌 T75 培养瓶或 50 ml 圆底离心管中。通过反复吹打充分混匀血液与 PBS。
- 在完成全部血液采集后，准备另外四个 50 ml 圆底离心管，并在每管中加入 15 ml Ficoll-Paque Plus。
- 缓慢将每管 30–35 ml 血细胞液叠加于 Ficoll 液面上方。保持 Ficoll 与血细胞之间界面清晰分明。
- 在室温下以 500×g 离心 20 分钟。关闭离心机刹车，并将加速度调至最低，以维持各层之间清晰的界面。
- 使用血清移液管小心吸取 PBMC 层，并将 PBMC 收集至新的 50 ml 圆底离心管中。收集全部 PBMC 后，加入 30 ml PBS，在 400×g 条件下离心 10 分钟。弃去上清液，并再用 30 ml PBS 洗涤一次，以彻底去除残留的 Ficoll。
- 使用 Miltenyi 人 CD8+ T 细胞分离试剂盒，按照制造商提供的操作说明进行 CD8+ T 细胞分离。该试剂盒通过去除 CD8- 细胞，可高度富集 CD8+ 细胞（通常 >95%）。
- 计数 CD8+ T 细胞。预期纯度应高于 95%。为确认纯度，取 2×105 个细胞进行 CD4/3/8 流式细胞术分析。剩余的 CTL 可立即用于抗原特异性 aAPC 刺激，也可冻存以备后续使用。
4. 体外 基于aAPC的培养系统
- 准备培养基
- 用于TF（T细胞生长因子，实验室制备4）的2倍浓度培养基：完全RPMI培养基，添加5%供体自体血浆和8% T细胞生长因子。
- 供体自体血浆可用热灭活的人AB血清替代。
- 将100万CTL重悬于8 ml TF 2X培养基和8 ml完全RPMI培养基中，加入1×106个aAPC，充分混匀。
- 使用多通道移液器将细胞接种至96孔U型底组织培养板中（每孔160 μl）。
- 将细胞在37°C、5% CO2培养箱中培养7天。在第4天每孔补充80 μl TF 2X培养基。
- 第7天可收获细胞。收获后，将细胞置于磁铁旁，去除旧的aAPC。
- 抗原特异性可通过四聚体染色法检测，具体操作按照试剂生产商的说明书进行。表型染色和胞内细胞因子染色参照我们之前的研究方法3。
- 收获的细胞可在相同条件下再次与aAPC共培养。经过多次刺激后，细胞数量和抗原特异性预期会增加。
5. 代表性结果：
图4展示了aAPC在与HLA A2-Ig和抗-CD28偶联后的示例。通过相应抗体染色的明显偏移可判断蛋白偶联成功。外周血中CMV特异性CTL的频率通常为0.5–1%，而在aAPC介导刺激一周后，特异性可达55–93%（图2和图3）。不同供体之间抗原特异性CTL的扩增程度可能存在较大差异，但在同一供体中结果具有可重复性。根据推算，与直接取自体外（ex vivo）的前体细胞水平相比，CMV特异性细胞的扩增可达数千倍（数据未显示）。细胞内细胞因子染色（图3）显示，经过长期培养和显著增殖后，这些扩增的CTL具有多效功能，而非耗竭状态。
图1. 基于人工抗原呈递细胞（aAPC）体外扩增人细胞毒性T淋巴细胞（CTL）用于同种异体造血干细胞移植（HSCT）中过继性免疫治疗的代表性流程图
图2. 经aAPC共培养一周后生成的CMV特异性CTL的代表性四聚体染色结果
图 3. 由人工抗原呈递细胞（aAPC）诱导生成的针对巨细胞病毒（CMV）特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的代表性胞内细胞因子染色结果（CMV 特异性为 61%）
图4. M-450环氧珠在蛋白偶联后，使用抗小鼠IgG1-PE和抗小鼠IgG2a-FITC染色的代表性染色结果
讨论
本文所述的aAPC系统是一种高效的人类细胞毒性T淋巴细胞（CTL）体外扩增系统，可用于针对多种抗原的CTL扩增。在实验过程中，需特别注意蛋白质偶联的质量，以及在96孔板培养中aAPC与CTL的均匀分布。采用该方法，我们已成功将CTL扩增超过8周，并在此期间将抗原特异性CTL扩增达一百万倍4。目前已开发出多种基于细胞系或其他无细胞平台的人工抗原呈递细胞（APC）系统5；然而，根据已发表的数据，每种系统在扩增能力与特异性方面均具有独特特征，适用于不同的应用场景。尤为重要的是，由于CTL的质量与其数量同等重要，本系统所产生的巨细胞病毒（CMV）特异性CTL具备多效功能，预期可带来更优的抗病毒效果。
致谢
感谢 Aaron Selya 提供的有益讨论。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 AI29575、CA108835、AI077097（授予 JS）、约翰·霍普金斯大学疟疾研究所的试点项目资助以及美国国防部资助项目 PC 040972（授予 M.O.）支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 真空采血管（含肝素） | BD Biosciences | 367874 | |
| 人CD8+ T细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-094-156 | |
| Dynabeads M-450 Epoxy | Invitrogen | 140.11 | |
| Dynal MPC-1 磁力架 | Invitrogen | 120-01D | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| RPMI 1640 培养基 | GIBCO, by Life Technologies | 11875 | |
| HLA-A2-Ig 二聚体 X | BD Biosciences | 551263 | |
| iTAgMHC 四聚体（HLA-A2-CMV）-PE | Beckman Coulter Inc. | T20099 | |
| Falcon 透明 96 孔微孔板 | BD Biosciences | 353077 | |
| 大鼠抗小鼠 IgG2a-FITC | BD Biosciences | 553390 | |
| 山羊抗小鼠 IgG1-PE | Invitrogen | P21129 | |
| 人 AB 型血清 | Atlanta Biologicals | S40110 | |
| 小鼠抗人 CD8a-FITC | Sigma-Aldrich | F0772 | |
| 小鼠抗人 CD8a-APC | BD Biosciences | 340684 | |
| 小鼠抗人 IFNγ-FITC | BD Biosciences | 340449 | |
| 小鼠抗人 TNFα-PE | BD Biosciences | 340512 |
参考文献
- Walter, E. A. Reconstitution of cellular immunity against cytomegalovirus in recipients of allogeneic bone marrow by transfer of T-cell clones from the donor. N Engl J Med. 333, 1038-1038 (1995).
- Rosenberg, S. A. Adoptive cell transfer: a clinical path to effective cancer immunotherapy. Nat Rev Cancer. 8, 3669-3669 (2008).
- Oelke, M. Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells. Nat Med. 9, 619-619 (2003).
- Oelke, M. Artificial antigen-presenting cells: artificial solution for real diseases. Trends Mol Med. 11, 412-412 (2005).
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