我们介绍了一种在轴突损伤后从背根神经节组织中进行染色质免疫沉淀的方法。该方法可用于鉴定特定转录因子的结合位点以及组蛋白和DNA的表观遗传修饰，这些修饰对于周围和中枢神经系统中受损轴突的再生具有重要意义。
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本文内容
摘要
摘要
中枢神经系统（CNS）中的轴突在损伤后无法再生，而外周神经系统（PNS）中的轴突则能在一定程度上再生（Teng et al., 2006）。目前已认识到，在PNS中，损伤后会重新激活对神经突和轴突生长至关重要的转录程序（Makwana et al., 2005）。然而，可用于在活体（in vivo）条件下分析神经元基因调控的工具仍然有限，且常常具有挑战性。
背根神经节（DRG）是一种优良的损伤模型系统，因为中枢神经系统（CNS）和外周神经系统（PNS）均由起源于同一胞体的分叉轴突所支配。神经节代表了一组离散的细胞体集合，所有转录事件均在此发生，因此提供了一个明确定义的转录活性区域，可从动物体内简便且可重复地分离获取。在外周神经系统（如坐骨神经）中，神经纤维损伤后能够发生轴突再生，这应会揭示出一组与中枢神经系统（如脊髓）中类似损伤所引发的不同的转录程序，因为在中枢神经系统中再生无法发生。通过染色质免疫沉淀（ChIP）技术，可以鉴定在PNS或CNS损伤后转录因子结合位点以及组蛋白和DNA发生的修饰变化。
本文介绍了一种利用轴突损伤后固定的小鼠背根神经节（DRG）组织进行染色质免疫沉淀（ChIP）的实验方案。这一强有力的方法组合为表征促进轴突再生所必需的促再生染色质环境提供了有效手段。
方案
1. 坐骨神经与背柱神经损伤
- 将动物置于手术巾上，其下方全程放置恒温垫，以维持小鼠体温在37°C。所有动物均通过持续吸入异氟烷/O2进行手术麻醉。手术器械在使用前均经高压灭菌处理。
- 进行坐骨神经损伤操作时，需仔细剃除双侧后肢的毛发，并使用普通脱毛剂完成脱毛，随后用酒精清洁皮肤，再用碘伏溶液消毒3次。
- 通过在股骨中段后侧平行于股骨方向做4 mm的皮肤切口，并用精细镊子分离股二头肌的肌肉组织，从而暴露坐骨神经。
- 暴露的坐骨神经随后被损伤，皮肤则用两个缝合夹闭合。
注意：采用相同的切口暴露坐骨神经，但缝合伤口以保持神经完整，用于假手术损伤对照。
- 对于背柱损伤，需小心剃除小鼠背部的毛发，并使用普通脱毛剂完成脱毛，然后用酒精喷雾/擦拭清洁皮肤。
- 通过从约T7至T13处做一条2.5 cm的切口暴露脊髓。将皮肤分开，沿T9至T11椎骨去除结缔组织。
- 在T10水平进行椎板切除术
注意：在大多数实验中，椎板切除术被视为假手术损伤。
- 向组织中加入几滴利多卡因（Xylocain），以麻醉脊髓，同时小心去除硬脊膜，注意不要触碰脊髓。
- 损伤背柱后，缝合肌肉，再次注意避免接触脊髓。最后使用缝合夹将皮肤闭合。应给予布托啡诺（Buprenorphine）（0.1 mg/kg 体重），每日两次，持续48小时，或直至不再需要为止。
2. 交联
- 处死小鼠后，解剖取出L4和L5节段的背根神经节（DRG）。将总共16个DRG收集至冰上预冷的HBSS缓冲液中，并加入蛋白酶抑制剂混合物（每只动物取2个损伤侧DRG和2个假手术侧DRG，共4只动物）。
- 短暂离心DRG样本，小心吸除HBSS，加入500 μl含蛋白酶抑制剂混合物的1%多聚甲醛PBS溶液，于37°C孵育30分钟。
关键步骤。 使用新鲜的分子生物学级甲醛。
- 加入 125 mM 甘氨酸以终止固定，室温孵育 5 分钟。
- 短暂离心，吸除缓冲液，用 500 μl 冰冷的 PBS + 蛋白酶抑制剂混合液洗涤组织两次。
3. 细胞核制备与染色质剪切
- 吸去 PBS，加入 400 μl SDS 裂解缓冲液，转移至预冷的微量离心管中，用微型研杵进行约 30 次研磨以破碎组织。
关键步骤。 组织的裂解和破碎对于获得高产量的交联染色质至关重要。
- 使用超声波处理样品，70% 输出功率下进行 8 次脉冲，每次 10 秒（Bandelin, Sonoplus GM70）。
注意。 染色质的剪切需根据您特定的超声破碎条件进行优化，在进行实际的免疫沉淀实验之前，应先检测染色质是否已得到适当的片段化（参见第3节）。
注意。 染色质的片段化也可通过微球菌核酸酶（MNase）消化实现。一般而言，超声处理更适合固定组织的染色质片段化，而MNase消化则更适用于天然组织的染色质免疫沉淀。交联并剪切的染色质可在-80°C下保存长达2个月，但应避免反复冻融。
4. 染色质消化分析（推荐）
- 取10 μl剪切后的染色质样品用于分析。向样品中加入200 mM NaCl，并在65°C下孵育2小时以逆转交联。
- 纯化DNA（见第8节），并进行1%琼脂糖凝胶电泳。DNA应被片段化至约200-1000 bp的长度（图1）。
注意。 染色质过度片段化可能导致信号减弱，而片段化不完全则会导致分辨率降低和背景信号升高。
5. 免疫沉淀
- 确定免疫沉淀反应的数量（见下文注意事项），并将样品等分至新的离心管中。每管用 ChIP 缓冲液加蛋白酶抑制剂混合物补足至 500 μl。
- 取 5 μl 稀释后的样品转移至新管中。此为 1% 输入样品，将其储存于 -20°C，待后续使用（第 7 节）。
- 针对每个免疫沉淀反应，加入相应的抗体或正常 IgG 对照，并于 4°C 条件下旋转孵育过夜。
注意。 在确定免疫沉淀反应数量时，应设置阳性对照（例如组蛋白 H3 抗体）和阴性对照（正常 IgG）。每次免疫沉淀所用抗体的用量因抗体而异，需通过实验确定。但通常用量范围为 2-10 µg/次免疫沉淀。
- 为了免疫沉淀您的抗体/蛋白质/DNA复合物，加入30 μl ChIP级Protein G磁珠，在4°C下旋转孵育2小时。
6. 清洗
- 为沉淀结合染色质的磁珠复合物，将离心管置于磁力架上。待溶液变澄清后，小心移除上清液。
- 向磁珠中加入 1 ml 低盐洗涤缓冲液（ChIP 缓冲液），在 4°C 下旋转孵育 3–5 分钟，然后按步骤 6.1 操作沉淀磁珠并吸除洗涤液。重复此步骤，共洗涤 3 次。
- 向磁珠中加入 1 ml 高盐洗涤缓冲液（ChIP 缓冲液 + 350 mM NaCl），旋转孵育 3–5 分钟，然后按步骤 6.1 操作沉淀磁珠并吸除洗涤液。
7. 洗脱与交联的逆转
- 从 -20°C 取出您的输入样品，加入 150 μl ChIP 洗脱缓冲液，并在室温下放置至第 7.5 步。
- 为第 6.3 步中的每个免疫沉淀样品加入 150 μl 1x ChIP 洗脱缓冲液。
- 将离心管放入恒温混匀仪中，于 65°C 孵育 30 分钟并轻柔涡旋，以使染色质从磁珠上洗脱。
- 将磁珠置于磁力架上，小心地将洗脱的染色质（上清液）转移至新的离心管中。
- 向所有离心管（包括您的输入样品）中加入 200 mM NaCl 和每反应 40 μg 蛋白酶 K，并在 65°C 孵育 2 小时。
注意。 洗脱步骤也可在室温下进行，但效率可能较低。
8. DNA 回收
- 向第7.5步的样品中加入1体积的苯酚/氯仿，涡旋振荡30秒。
- 在室温下，以微量离心机最高速度离心5分钟。
- 小心转移水相（上层）至新的离心管中，向水相中加入1体积氯仿，涡旋振荡30秒。
- 在室温下，以微量离心机最高速度离心5分钟。
- 小心转移水相（上层）至新的离心管中，然后加入300 mM NaOAc、每反应20 μg的糖原以及2.5体积的预冷100%乙醇。
注意。 需添加载体（如糖原）以增强相对较小的DNA片段的沉淀。
- 在 -80°C 下孵育 2 小时以沉淀 DNA。
注意。 沉淀步骤也可在 -20°C 下过夜进行。
- 将样品在4°C下以微量离心机最高速度离心20分钟。
- 小心去除上清液，并用300 μl预冷的70%乙醇洗涤沉淀的DNA沉淀物。
- 将样品在4°C下以微量离心机最高速度离心10分钟。
- 尽可能小心地移除上清液，并让沉淀物在空气中干燥。
- 用20 μl无菌H2O重悬DNA。样品现可用于PCR，或可于-20°C保存。
9. 代表性结果
坐骨神经损伤后背根神经节（DRGs）中染色质免疫沉淀（ChIP）实验的代表性结果如图1和图2所示。首先，我们展示了DNA被片段化至约200-1000 bp的长度（图1）。其次，仅在坐骨神经损伤后，从生长相关蛋白-43（GAP-43）近端启动子区域的ChIP产物中检测到PCR信号（图2，5'，第4泳道）。当动物仅接受假手术损伤时（第3泳道），或使用正常IgG血清进行免疫沉淀（IP）时（第5和第6泳道），均未检测到PCR信号。为验证抗体的特异性，我们使用同一DNA样本，但采用一组对照引物，该引物扩增目标基因3'-非翻译区（3'-UTR）的一个区域，该区域预期无蛋白结合。除作为标准PCR对照的输入样本（input，代表未进行IP的DNA样本，图2第1-2泳道）外，所有泳道均未出现PCR信号（图2，3'，第3-6泳道）。如示意图（图3）所示，该ChIP实验流程可用于坐骨神经损伤或脊髓背柱损伤后的样本分析。
图1. 经超声处理将DNA剪切至合适片段长度范围后，进行逆转交联的琼脂糖凝胶电泳结果。
图2. 坐骨神经损伤后背根神经节（DRG）组织的半定量PCR结果，显示乙酰化p53在神经损伤后48小时结合于GAP-43近端启动子区域。来自相同DRG组织的对照PCR显示，乙酰化p53不结合于GAP-43基因3’-非翻译区（UTR）的对照DNA区域（S = 假手术组，I = 损伤组）。
图3. 示坐骨神经和背柱上损伤部位位置的通用示意图。
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讨论
本方案提供了一种方法，用于直接探究成年神经系统在轴突损伤后轴突再生过程中的染色质环境。该方法结合背根神经节（DRG）损伤模型与染色质免疫沉淀技术，以研究周围神经系统（PNS）或中枢神经系统（CNS）损伤后的转录及表观遗传环境。该方案特别适用于希望表征其感兴趣的转录因子潜在结合位点，并确定这些位点的占据是否在损伤后发生的科研人员。同时，也可对这些位点处组蛋白和DNA的表观遗传修饰进行同步监测。类似方案亦可用于面神经损伤后实验，其中可从脑干分离面神经核，并按我们先前报道的方法进行染色质免疫沉淀分析（Tedeschi et al., 2009）。
与典型的染色质免疫沉淀实验类似，本方案中的两个关键步骤是：（1）DNA-蛋白质复合物的有效片段化和溶解；（2）针对目标蛋白的优质免疫沉淀抗体的可获得性。可能影响这两个步骤的一个限制因素是起始材料量过少。与其他组织（如脑或脊髓）相比，背根神经节（DRG）所能提供的组织量相对较少。此外，DRG 包含多种类型的神经元以及胶质细胞，这些细胞可能具有不同的染色质环境，从而可能导致免疫沉淀信号的异质性；然而，这种局限性在大多数来自神经系统...
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致谢
我们感谢Andrea Tedeschi在实验室建立初始ChIP实验过程中提供的帮助，以及Ricco Lindner在优化ChIP实验条件方面的贡献。本研究得到了赫蒂基金会（Hertie Foundation）、蒂宾根大学福琼基金（Fortune Grant）以及德国研究基金会（DFG DI 1497/1-1）项目的资助（以上项目均授予Simone Di Giovanni）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10x ChIP 缓冲液 | Cell Signaling Technology | 7008 | |
| 2x ChIP 洗脱缓冲液 | Cell Signaling Technology | 7009 | |
| ChIP 级 Protein G 磁珠 | Cell Signaling Technology | 9006 | |
| Magna Grip 架（8 孔） | EMD Millipore | 20-400 | |
| 氯仿 | Merck & Co., Inc. | UN 1888 | |
| 37% 甲醛 | Carl Roth Gmbh | CP10.1 | |
| 10x 甘氨酸溶液 | Cell Signaling Technology | 7005 | |
| 糖原 | Sigma-Aldrich | G1767 | |
| 10x HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14185 | |
| 组蛋白 H3 抗体（兔源） | Cell Signaling Technology | 2650 | |
| 正常兔 IgG | Cell Signaling Technology | 2729 | |
| 苯酚/氯仿/异戊醇 | Carl Roth Gmbh | A156.1 | |
| 蛋白酶抑制剂混合片剂 | Roche Group | 04 693 116 001 | |
| 蛋白酶 K（20 mg/ml） | Cell Signaling Technology | 10012 | |
| SDS 裂解缓冲液 | Upstate, Millipore | 20-163 |
参考文献
- Beirowski, B. Quantitative and qualitative analysis of Wallerian degeneration using restricted axonal labelling in YFP-H mice. Journal of Neuroscience Methods. 134, 23-35 (2004).
- Carey, M. F. Chromatin immunoprecipitation (ChIP). , Cold Spring Harb. Protocol. (2009).
- Dahl, J. A. A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (μChIP. Nat. Protoc. 3, 1032-1045 (2008).
- Haring, M. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 11, 3-11 (2007).
- Jiang, Y. Isolation of neuronal chromatin from brain tissue. BMC Neurosci. 9, 42-42 (2008).
- Lee, A. Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum. Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).
- Makwana, Molecular mechanisms in successful peripheral regeneration. Febs J. 272, 2628-2638 (2005).
- Tedeschi, A. A p53-CBP/p300 transcription module is required for GAP-43 expression, axon outgrowth, and regeneration. Cell Death and Differentiation. 16, 543-554 (2009).
- Teng, F. Y. Axonal regeneration in adult CNS neurons--signaling molecules and pathways. J Neurochem. 96, 1501-1508 (2006).
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