我们介绍了一种在轴突损伤后从背根神经节组织中进行染色质免疫沉淀的方法。该方法可用于鉴定特定转录因子的结合位点以及组蛋白和DNA的表观遗传修饰，这些修饰对于周围和中枢神经系统中受损轴突的再生具有重要意义。
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本文内容
摘要
摘要
中枢神经系统（CNS）中的轴突在损伤后无法再生，而外周神经系统（PNS）中的轴突则能在一定程度上再生（Teng et al., 2006）。目前已认识到，在PNS中，损伤后会重新激活对神经突和轴突生长至关重要的转录程序（Makwana et al., 2005）。然而，可用于在活体（in vivo）条件下分析神经元基因调控的工具仍然有限，且常常具有挑战性。
背根神经节（DRG）是一种优良的损伤模型系统，因为中枢神经系统（CNS）和外周神经系统（PNS）均由起源于同一胞体的分叉轴突所支配。神经节代表了一组离散的细胞体集合，所有转录事件均在此发生，因此提供了一个明确定义的转录活性区域，可从动物体内简便且可重复地分离获取。在外周神经系统（如坐骨神经）中，神经纤维损伤后能够发生轴突再生，这应会揭示出一组与中枢神经系统（如脊髓）中类似损伤所引发的不同的转录程序，因为在中枢神经系统中再生无法发生。通过染色质免疫沉淀（ChIP）技术，可以鉴定在PNS或CNS损伤后转录因子结合位点以及组蛋白和DNA发生的修饰变化。
本文介绍了一种利用轴突损伤后固定的小鼠背根神经节（DRG）组织进行染色质免疫沉淀（ChIP）的实验方案。这一强有力的方法组合为表征促进轴突再生所必需的促再生染色质环境提供了有效手段。
方案
1. 坐骨神经与背柱神经损伤
- 将动物置于手术巾上，其下方全程放置恒温垫，以维持小鼠体温在37°C。所有动物均通过持续吸入异氟烷/O2进行手术麻醉。手术器械在使用前均经高压灭菌处理。
- 进行坐骨神经损伤操作时，需仔细剃除双侧后肢的毛发，并使用普通脱毛剂完成脱毛，随后用酒精清洁皮肤，再用碘伏溶液消毒3次。
- 通过在股骨中段后侧平行于股骨方向做4 mm的皮肤切口，并用精细镊子分离股二头肌的肌肉组织，从而暴露坐骨神经。
- 暴露的坐骨神经随后被损伤，皮肤则用两个缝合夹闭合。
注意：采用相同的切口暴露坐骨神经，但缝合伤口以保持神经完整，用于假手术损伤对照。
- 对于背柱损伤，需小心剃除小鼠背部的毛发，并使用普通脱毛剂完成脱毛，然后用酒精喷雾/擦拭清洁皮肤。
- 通过从约T7至T13处做一条2.5 cm的切口暴露脊髓。将皮肤分开，沿T9至T11椎骨去除结缔组织。
- 在T10水平进行椎板切除术
注意：在大多数实验中，椎板切除术被视为假手术损伤。
- 向组织中加入几滴利多卡因（Xylocain），以麻醉脊髓，同时小心去除硬脊膜....
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讨论
本方案提供了一种方法，用于直接探究成年神经系统在轴突损伤后轴突再生过程中的染色质环境。该方法结合背根神经节（DRG）损伤模型与染色质免疫沉淀技术，以研究周围神经系统（PNS）或中枢神经系统（CNS）损伤后的转录及表观遗传环境。该方案特别适用于希望表征其感兴趣的转录因子潜在结合位点，并确定这些位点的占据是否在损伤后发生的科研人员。同时，也可对这些位点处组蛋白和DNA的表观遗传修饰进行同步监测。类似方案亦可用于面神经损伤后实验，其中可从脑干分离面神经核，并按我们先前报道的方法进行染色质免疫沉淀分析（Tedeschi et al., 2009）。
与典型的染色质免疫沉淀实验类似，本方案中的两个关键步骤是：（1）DNA-蛋白质复合物的有效片段化和溶解；（2）针对目标蛋白的优质免疫沉淀抗体的可获得性。可能影响这两个步骤的一个限制因素是起始材料量过少。与其他组织（如脑或脊髓）相比，背根神经节（DRG）所能提供的组织量相对较少。此外，DRG 包含多种类型的神经元以及胶质细胞，这些细胞可能具有不同的染色质环境，从而可能导致免疫沉淀信号的异质性；然而，这种局限性在大多数来自神经系统.......
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致谢
我们感谢Andrea Tedeschi在实验室建立初始ChIP实验过程中提供的帮助，以及Ricco Lindner在优化ChIP实验条件方面的贡献。本研究得到了赫蒂基金会（Hertie Foundation）、蒂宾根大学福琼基金（Fortune Grant）以及德国研究基金会（DFG DI 1497/1-1）项目的资助（以上项目均授予Simone Di Giovanni）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10x ChIP 缓冲液 | Cell Signaling Technology | 7008 | |
| 2x ChIP 洗脱缓冲液 | Cell Signaling Technology | 7009 | |
| ChIP 级 Protein G 磁珠 | Cell Signaling Technology | 9006 | |
| Magna Grip 架（8 孔） | EMD Millipore | 20-400 | |
| 氯仿 | Merck & Co., Inc. | UN 1888 | |
| 37% 甲醛 | Carl Roth Gmbh | CP10.1 | |
| 10x 甘氨酸溶液 | Cell Signaling Technology | 7005 | |
| 糖原 | Sigma-Aldrich | G1767 | |
| 10x HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14185 | |
| 组蛋白 H3 抗体（兔源） | Cell Signaling Technology | 2650 | |
| 正常兔 IgG | Cell Signaling Technology | 2729 | |
| 苯酚/氯仿/异戊醇 | Carl Roth Gmbh | A156.1 | |
| 蛋白酶抑制剂混合片剂 | Roche Group | 04 693 116 001 | |
| 蛋白酶 K（20 mg/ml） | Cell Signaling Technology | 10012 | |
| SDS 裂解缓冲液 | Upstate, Millipore | 20-163 |
参考文献
- Beirowski, B. Quantitative and qualitative analysis of Wallerian degeneration using restricted axonal labelling in YFP-H mice. Journal of Neuroscience Methods. 134, 23-35 (2004).
- Carey, M. F. Chromatin immunoprecipitation (ChIP). , Cold Spring Har....
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