该研究描述了一种经济有效的方法，利用qPCR对人类/猪/牛源DNA病毒（腺病毒和多瘤病毒）进行特异性定量，以确定水中粪便/尿液污染或硝酸盐污染的来源，上述病毒被提议作为微生物源追踪（MST）工具。
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摘要
摘要
环境中微生物污染构成重大的健康风险。传统的细菌性粪便指示物已被证明存在显著局限性，而病毒对许多灭活过程更具抗性，且标准粪便指示物无法提供污染来源的信息。开发经济高效的病毒浓缩方法以及分子检测技术，有助于将病毒作为粪便污染指示物和微生物源追踪（MST）工具加以应用。腺病毒和多瘤病毒是感染包括人类在内的特定脊椎动物的DNA病毒，在所有已研究的地理区域中，均能在粪便和/或尿液中持续排出。在先前的研究中，我们提出通过定量PCR（qPCR）对人腺病毒（HAdV）和JC多瘤病毒（JCPyV）进行定量，作为人类粪便污染的指标。近期，我们已开发出用于特异性定量猪腺病毒（PAdV）和牛多瘤病毒（BPyV）的qPCR检测方法，作为动物粪便污染标志物，其检测灵敏度可达每反应管1-10个基因组拷贝。在本研究中，我们介绍了利用这些工具识别水样中污染来源的操作流程。作为代表性结果的示例，展示了对硝酸盐含量较高的地下水中病毒的分析结果。
在低至中等污染程度的水体中检测病毒，需要将至少数升水样中的病毒浓缩至更小的体积，该过程通常包括连续进行的两个浓缩步骤。这一略显繁琐的程序以及病毒回收率的不稳定性，显著阻碍了对大量水样进行同步处理。
为了消除两步法程序造成的瓶颈，我们采用了一种在先前研究中开发的一步法方案，该方案适用于多种水体基质。该程序包括：对十升水样进行酸化处理，利用脱脂牛奶进行絮凝，絮凝物通过重力沉降，收集沉淀物并进行离心，将沉淀物重悬于10 ml磷酸盐缓冲液中。所得病毒浓缩液用于提取病毒核酸，并通过qPCR定量目标腺病毒和多瘤病毒。利用这种低成本的浓缩方法，可同时分析大量样品。
该方法已应用于浴场水、海水和河水的分析，本研究中我们展示了对地下水样品的分析结果。这种高通量定量方法具有可靠性高、操作简便和成本效益好的优点。
方案
1. 水样中病毒颗粒的浓缩
- 水样的采集与预处理
- 使用平底塑料容器，每份样品至少采集2个10 L的重复样本，并额外采集一份作为过程对照。该对照样本将加入已知数量的病毒颗粒，用作控制。
注意：建议为加标样本准备专用的独立材料（如瓶子、试管等）。 - 检查电导率仪的校准情况，必要时重新校准。另取一个10 L塑料容器，用经调节至适当电导率的自来水（见下文1.6）制备阴性对照。
- 对于加标样本：加入标准体积的对照病毒（约每10 L水中含105个基因拷贝）。通过搅拌混合，避免飞溅和气溶胶产生。阳性对照可选用非常见的腺病毒株，如HAdV-35，或噬菌体如MS2。
- 若样品中含有大量悬浮物（如沙粒或其他物质），静置15分钟使其沉降，然后将上清液转移至新容器中。
- 通过加入1 N HCl将水样pH调节至3.5（±0.1）。此步骤对病毒浓缩至关重要，需确保pH已准确调节。在加入HCl时剧烈搅拌，充分混匀。（注意：若pH低于3.5，则加入1 M NaOH进行调节）。
- 调节电导率。若样品电导率≥1500 μS/cm，则无需此步骤；若电导率低于1500 μS/cm，则无法保证形成絮状沉淀（flocs），因此需通过加入人工海盐（Sigma）将电导率调节至1500 μS/cm。在加入海盐时剧烈搅拌以充分混合。
- 记录样品在预处理前后pH值以及所用HCl体积。调节pH后也应记录电导率。每次使用后，必须用新鲜HCl溶液对pH计和电导率仪电极进行消毒，再用10%硫代硫酸钠溶液脱氯，最后用蒸馏水冲洗。
- 使用平底塑料容器，每份样品至少采集2个10 L的重复样本，并额外采集一份作为过程对照。该对照样本将加入已知数量的病毒颗粒，用作控制。
- 预絮凝脱脂牛奶（PSM）溶液的制备（1%）
- 检查pH计和电导率仪的校准情况，必要时重新校准。
- 通过将10 g脱脂奶粉（Difco）溶于1 L人工海水（将33.3 g人工海盐溶于1 L脱氯自来水，高压灭菌）中，配制1%（w/v）预絮凝脱脂牛奶（PSM）溶液，并用1 N HCl小心调节pH至3.5。此时应可见絮状物形成。该溶液应在使用前新鲜配制，或在4°C下保存不超过24小时。脱氯处理方法为：每100 ml水样中加入1 ml 10%硫代硫酸钠溶液。
- 水样中病毒颗粒的絮凝
- 向10 L水样中加入100 ml 1% PSM溶液。
- 搅拌8–10小时，使病毒充分吸附至絮状物上。使用定时器，在8–10小时后自动停止搅拌。
- 停止搅拌，静置8–10小时，使絮状物通过重力自然沉降。
- 收集并重新溶解絮状物。离心
- 使用蠕动泵和连接塑料管的塑料移液管移除上清液。对于加标样本，上清液应收集至容器中，并按照内部规程进行消毒处理。所有情况下均需注意：切勿收集沉淀物。
- 将含有絮状物的沉淀（约500 ml）收集至离心管中。
- 通过加入pH 3.5的PSM溶液平衡离心管重量。
- 在高速离心机中以8,000 × g、4°C离心30分钟。离心结束后立即小心取出离心管。
- 非常轻柔地倾倒并弃去上清液。处理具有感染性的材料时应采取适当防护措施。
- 向每个离心管中加入7 ml磷酸盐缓冲液，以溶解沉淀物。
- 待絮状物完全溶解后，测量体积，并补加磷酸盐缓冲液至总体积为10 ml。
- 通过涡旋振荡混匀病毒浓缩液，将10 ml溶液分装至洁净的微量离心管中，于-80°C冷冻保存，待后续分析时使用。
2. 核酸提取
- 按照制造商说明，使用 QIAamp Viral RNA Mini Kit 进行核酸提取。该试剂盒可配合自动化平台（如 Qiacube, Qiagen）使用。
3. 人腺病毒（HAdV）、JC 多瘤病毒（JCPyV）、猪腺病毒（PAdV）和牛多瘤病毒（BPyV）的定量 PCR
- 样品中基因组拷贝数的定量
- 在洁净的独立区域中，使用 TaqMan Environmental PCR Master Mix 2x（Applied Biosystems）配制 qPCR 反应体系。反应在96孔光学反应板中进行，并用光学粘性封板膜覆盖。Master Mix、引物和探针的浓度详见表1。
- 配制好反应混合液后，将15μl分装至各孔中（包括对照孔，见3.2）。加入目标样本后，单个反应的总体积为25μl（15μl混合液 + 10μl样本或标准品）。
- 在另一个独立区域中，加入各样本的核酸提取物（10μl）。每个样本需进行直接检测以及在纯化水中进行10倍稀释，并设两个重复。用粘性封板膜的一部分覆盖含样本的孔，保留另一部分用于后续步骤。
- 使用专用于标准DNA的移液器，以三重复方式加入从100到106 GC/10μl的DNA标准品稀释液（10μl）。建议在配备紫外线照射装置的区域中操作标准品，以降解可能残留的质粒DNA，并在每次使用后清洁移液器。用预先裁剪好的粘性封板膜覆盖含标准品的孔。
注：为制备用于基因组拷贝数定量的标准品，应将目标DNA片段克隆至质粒中并进行线性化处理。以下网址提供有关如何使用质粒DNA模板构建qPCR标准曲线的详细操作流程：
http://www.appliedbiosystems.com/support/tutorials/pdf/quant_pcr.pdf - 在合适的qPCR系统中运行反应，并选择适当的参数（考虑使用粘性封板膜及每孔总体积等因素）。首先在95°C下激活AmpliTaq Gold 10分钟，随后进行40个循环的扩增：对于HAdV、JCPyV和BPyV，条件为95°C 15秒和60°C 1分钟；对于PAdV，条件为95°C 15秒、55°C 20秒和60°C 20秒。
- 反应完成后，按照所用设备的用户手册说明存储数据和结果。DNA含量将根据校正稀释倍数后的数据中位数确定。
- 对照设置
- 需使用阳性和阴性对照。检测必须包含多个无模板对照（NTC），以验证反应体系本身不产生荧光信号。建议同时运行阳性过程对照，以评估研究样本中可能存在的抑制物对酶活性的潜在抑制作用。
- 记录标准DNA两个不同稀释度以及过程对照的qPCR检测结果。利用这些结果建立控制图，用于与检测灵敏度和效率相关的质量控制（QC）程序。
- 结果确认
- 阳性结果可通过巢式PCR及扩增子的核苷酸测序进一步验证，从而获得所检测毒株的更多核苷酸序列信息1,5,6,7,9,12。
根据所述方法，已在浴场水、海水和河水样本中检测并定量了人和动物病毒2,3。作为代表性示例，研究人员对硝酸盐含量较高的区域的地下水样本进行了分析，以确定污染来源。从西班牙东北部农村地区的4口水井中各采集10升水样，每口井采集5个重复样本，其中1个重复样本接种人腺病毒2型，作为过程对照。样本按照图1所示的方案进行处理。在4个采样点之一的4个重复样本中，猪腺病毒（PAdV）检测结果呈阳性（平均值为7.74×102 GC/L），表明采样点周边存在猪粪浆，支持猪粪污染是地下水中硝酸盐来源的推断（表2）。
4. 代表性结果：
图 1. 水中病毒检测与定量的操作流程。
表 1. qPCR检测中引物和探针的浓度。
表2. 地下水样品中动物和人类腺病毒及多瘤病毒的检测与定量。
n 分析的重复次数
% 阳性重复样本的百分比
(-) 未检出
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讨论
所述方法可满足常规环境与公共卫生实验室所要求的适用条件：可重复、可靠、简便且经济有效。该方案虽简单，但必须严格遵循操作步骤。若样品中未添加规定浓度的人工海水盐，则电导率过低，会导致病毒回收率显著降低；同样，若絮凝过程的搅拌时间明显缩短（例如少于5小时），病毒回收率也会大幅下降。
目前应用的微生物源追踪（MST）工具通常基于分子技术。不同研究团队开展的研究表明，在当前使用的各种参数（即细菌基因）中，没有任何单一参数具有足够的特异性。因此，建议采用多种参数组合的方式，作为有效追踪水体中粪便污染来源的最佳策略8,11。
近年来，针对某些在多数情况下不引起临床症状却可导致持续性感染的特定DNA病毒的研究，已成为一种用于追踪环境中粪便污染来源的方法。定量PCR技术及所提出的浓缩方法可提供这些病毒浓度的可靠数值，为风险评估研究和修复措施的制定提供极为宝贵的数据。这些技术还具有高度的灵敏性和特异性，这对于追踪污染源至关重要。此外，这些方法还将成为生成更大数据库的有力工具，用于对作为微生物源追踪工具的特定病毒在不同地理区...
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披露
2009年提交了两项专利申请，以保护PAdV和BPyV定量检测方案的知识产权。
致谢
本研究工作部分得到了西班牙政府“教育与科学部”（项目编号：AGL2008-05275-C01/ALI）、欧盟第七研究框架计划资助项目VIROBATHE（合同号：513648）、VIROCLIME（合同号：243923）以及加泰罗尼亚水务局（Agència Catalana de l'Aigua，ACA）水生生态系统监测与改善部门的资助。在本研究开展期间，Marta Rusiñol 获得了加泰罗尼亚政府“AGAUR”项目的资助（FI-DGR）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 高速离心机（8,000×g） | Berckman Coulter | Avanti J-20XP | |
| pH计、温度计和电导率仪 | Afora | LPPC3003 | |
| 长度为100-200 cm的塑料管 | Deltalab | 350059 | |
| 无菌刻度一次性移液管 | Labclinics | PN10E1 | |
| 1.5 mL 和 10-15 mL 的无菌塑料管（Eppendorf、Falcon等） | Afora | KA298/00 | |
| 离心瓶（500 mL） | Fisher Scientific | SE5753512 | |
| 磁力搅拌器和搅拌子（每个样品一个） | Fisher Scientific | 10510 | |
| 平底玻璃或塑料容器，可用于磁力搅拌 | Deltalab | 191642 | |
| 用于去除上清液的蠕动泵（或水射流真空泵） | Watson-Marlow Pumps Group | 323E/D | |
| 定时器，用于在搅拌8-10小时后关闭设备 | Deltalab | 900400 | |
| 盐酸（1N 和 0.1N） | Panreac | 141020.1611 | |
| 氢氧化钠（1N） | Panreac | 131687.1211 | |
| 人工海水盐 | Sigma-Aldrich | S9883 | |
| 脱脂牛奶（SM） | Difco Laboratories | 232100 | |
| 磷酸盐缓冲液 pH 7.5 | 将无菌的0.2 M Na2HPO4 与 0.2 M NaH2PO4 按1:2体积比混合，调节pH至7.5 | ||
| 硫代硫酸盐 | Panreac | 121879.1209 | 配制成10%的水溶液 |
| QIAamp 病毒RNA小型试剂盒 | Qiagen | 52904 | |
| 96孔光学反应板（500个单位） | Applied Biosystems | 43426659 | |
| 光学粘性封板膜（100个单位） | Applied Biosystems | 4311971 | |
| TaqMan 环境PCR预混液 2× | Applied Biosystems | 4396838 |
参考文献
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