利用基于病毒的Cre重组马赛克产后小鼠脑开发基因功能分析

Summary

一个在体内产后脑的方法来测试基因功能描述。表达CRE和/或荧光蛋白的重组自动增值服务注入新生小鼠大脑。马赛克基因的失活和稀疏的神经标签实现，使神经电路的发展过程的关键基因功能的快速分析。

Abstract

不仅依赖于胚胎发育的主要神经通路建立正常的脑功能，但也发育时神经回路的成熟和完善。 Misregulation在这个阶段，可能会导致神经和精神疾病，如自闭症^和精神分裂症1,2。许多基因已在胎儿的大脑研究，发现^许多 3-5发育过程至关重要。然而，他们在出生后大脑功能在很大程度上是未知的，部分原因是因为他们在小鼠的缺失往往会导致新生儿发育期间，以杀伤力，部分原因是因为他们在早期发展的要求，阻碍了产后的分析。为了克服这些障碍，这些基因的floxed等位基因，目前正在生成在^小鼠 6 。当结合表达Cre重组酶在特定的细胞类型，有条件的删除，可以实现在产后的大脑研究基因功能的转基因等位基因。然而，这种方法需要额外的等位基因和额外的时间（3-6个月），以产生适当的基因型的小鼠，从而限制了在鼠脑大规模扩展的遗传分析。

在这里，我们展示了一个互补的方法，使用病毒的表达Cre重组迅速，系统地研究这些floxed等位基因在出生后大脑发育。通过注入重组腺相关病毒^{（rAAVs）7,8}编码的Cre新生儿的大脑，我们可以删除该基因在大脑的不同区域的利益。通过控制病毒滴度和共表达荧光蛋白标记，我们可以同时实现镶嵌基因的失活和稀疏神经元的标签。这种方法绕过了许多基因在早期发展的要求，使我们能够学习他们的细胞自主的功能在许多关键的过程，在出生后大脑发育，包括轴突和树突状增长，分支，和平铺，以及突触的形成和完善。该方法已成功地使用在我们自己的实验室（未公布结果）和其他^8,9，并可以扩展到其他的病毒， ^如 9，以及慢病毒的shRNA或主导活性^蛋白 10的表达，。此外，通过与电相结合的技术，以及最近开发的光学^成像工具11，这种方法提供了一个新的战略，以研究如何遗传途径影响神经电路的发展和在小鼠和大鼠的功能。

Protocol

1。准备用于注射的病毒

1. rAAVs均购自商业供应商的建议，但他们也可以在自己的实验室中产生的（见下面的讨论）。 〜1 × ^12，每毫升的基因组副本（GC /毫升）的滴度和病毒解决方案通常是生产，可在全滴度用来处理大量的细胞。此外，他们可能会被摊薄产生稀疏标签的理想水平。适当稀释，必须由用户决定，但建议开始1:10稀释。
2. 使用前在冰上解冻病毒。转移到一个小（〜250μl）PCR管中的病毒解决方案所需的预稀释量。稀释病毒的解决方案，使用适当的音量在组织培养罩无菌DPBS。存储在冰块稀释病毒解决方案，直到需要它。

注意:处理所有病毒，应按照您的机构批准的与生物安全议定书进行

2。注射器装载和设备组装

1. 加载针连接的玻璃注射器和PCR管的病毒解决方案，轻轻拉出柱塞。拉出柱塞，直到注射器可以看到一个非常小的泡沫，空气，这表明，所有的解决方案是在注射器中，并没有留在装载针。此外，少量的惰性染料可以被添加到解决方案，以使其可见。
   注:应加载针通常没有足够长的时间，以达到大多数其它管子的底部使用一个小的PCR管。
2. 卸下装载的的针头和地方注射器注射泵块注射器，安全注射器固定。
3. 轻轻插入到注射器的连接管的一端插入另一端的持针器。插入注射针持针器。注射针到底应该直接接触的持针器的连接管内结束。

Discussion

这里介绍的新生儿病毒注射方法提供了一个简单而快速的方式来产生体内马赛克产后大脑发育的研究。该方法需要利用floxed等位基因目前可用的，以及那些正在通过高通量基因靶向项目^6。使用Cre转基因表达相比，这种方法提供了一种快速的方法来测试基因在不同细胞类型的功能，携带floxed等位基因的小鼠可直接用于实验，整个病毒注射过程从开始到结束，可在不到一小时完成。此外，感染细胞的数量，可以通过改变滴度的病毒，它允许单个神经元稀疏标签，很容易控制。虽然我们只描述的样本图像的神经元的形态分析，受感染的神经元可扩展到许多重要的发育过程，包括轴突和树突增长，分支和平铺，以及诸如脊柱形态发生突触发展。

程序的三个最关键的部分是针对注射部位，注射设备的可靠性，和幼崽的生存的准确性。第一个方面 - 精度 - 最好通过经验教训。注射设备的可靠性是指一个事实，就是必须确保有没有堵塞，渗漏，或与设备在注射之前，其他问题。最后，幼崽的生存通常不是一个问题，如果在步骤3.7中提到的提示之后。

此过程的一个明显的修改是使用.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂名称	公司	目录编号	评论（可选）
rAAV8 - CRE，- GFP - DsRed的，	矢量Biolabs公司	＃7060，＃7061，客户订单	http://www.vectorbiolabs.com
哈佛泵11加	哈佛器械	＃702208	（没有脚踏板端口）
视网膜色素上皮细胞注射套件	世界精密仪器	RPE - KIT	包含连通管，注射针（36G），持针器
NanoFil注射器，100微升	世界精密仪器	NANOFIL - 100	包括可重复使用的装载针
D - PBS	Invitrogen公司	14040-117
GFP抗体	鸟类	GFP - 1020
DsRed的抗体	Clontech公司	632496
加热块	VWR	97042-610
ROSA26R鼠标	杰克逊实验室	003309