利用基于病毒的Cre重组技术对小鼠出生后脑发育中基因功能进行嵌合体分析

摘要

介绍了一种在出生后大脑中测试基因功能的体内方法。将表达Cre和/或荧光蛋白的重组AAV注射到新生小鼠大脑中。通过实现基因的嵌合失活和稀疏神经元标记，可快速分析基因在神经环路发育关键过程中所发挥的功能。

摘要

正常的大脑功能不仅依赖于胚胎发育阶段主要神经元通路的建立，也依赖于出生后神经回路的成熟与精细调节。此阶段的调控异常可能导致自闭症和精神分裂症等神经及精神类疾病^1,2。许多基因已在产前大脑中被研究，并发现对多种发育过程至关重要^3-5。然而，这些基因在出生后大脑中的功能在很大程度上仍不清楚，部分原因是这些基因在小鼠中的敲除通常导致新生期致死，另一部分原因是它们在早期发育中的必要性阻碍了对出生后阶段的分析。为克服这些障碍，目前正通过构建这些基因的条件性等位基因（floxed alleles）的小鼠模型来解决这一问题⁶。当与表达Cre重组酶的转基因等位基因小鼠杂交时，可实现特定细胞类型中的条件性基因敲除，从而研究基因在出生后大脑中的功能。然而，该方法需要引入额外的等位基因，并耗费额外时间（3–6个月）以获得合适基因型的小鼠，从而限制了在小鼠大脑中大规模开展遗传学分析的应用。

本文展示了一种互补性方法，利用病毒表达的Cre重组酶，对出生后大脑发育过程中这些带loxP位点的等位基因进行快速、系统的分析。通过将编码Cre的重组腺相关病毒（rAAVs）^7,8 注射到新生动物脑内，我们能够在脑的不同区域特异性地敲除目标基因。通过调控病毒滴度并共表达荧光蛋白标记物，可同时实现基因的嵌合性失活和稀疏神经元标记。该方法规避了众多基因在早期发育中的必需性问题，使我们能够研究这些基因在出生后大脑发育多个关键过程中所发挥的细胞自主性功能，包括轴突和树突的生长、分支与覆盖，以及突触的形成与精细调节。本方法已在我们实验室（未发表结果）及其他研究团队^8,9 中成功应用，并可拓展至其他病毒系统，如慢病毒⁹，也可用于表达shRNA或显性活性蛋白¹⁰。此外，将该技术与电生理学以及近期发展的光学成像工具¹¹ 相结合，为研究遗传通路如何影响小鼠和大鼠神经环路的发育与功能提供了新的策略。

方案

1. 准备注射用病毒

1. 重组腺相关病毒（rAAVs）可从推荐的商业供应商处购买，也可在自有实验室中制备（见下文讨论）。病毒溶液通常以约1×10¹² 每毫升基因组拷贝数（GC/ml）的滴度制备，可直接使用该滴度以操控大量细胞。或者，也可将其稀释以实现所需程度的稀疏标记。合适的稀释倍数需由使用者自行确定，但建议初始稀释倍数为1:10。
2. 使用前立即在冰上解冻病毒。将所需稀释前体积的病毒溶液转移至一个小型（约250μl）PCR管中。在组织培养操作台中，用适量无菌DPBS稀释病毒溶液。稀释后的病毒溶液应置于冰上保存，直至使用时取出。

注意：所有病毒的操作均应根据您所在机构批准的生物安全规程进行

2. 注射器装样与设备组装

1. 将上样针连接至玻璃注射器，轻轻拉动活塞，从PCR管中吸取病毒溶液。持续拉动活塞，直至注射器内可见一个极小的气泡；这表明溶液已全部进入注射器，未残留在上样针中。或者，可在溶液中加入少量惰性染料，使其更易观察。
   注意：应使用小型PCR管，因为上样针通常不够长，无法触及大多数其他类型试管的底部。
2. 取下上样针，将注射器放置于注射泵的注射器架上，并用注射器固定夹固定。
3. 将连接管的一端轻轻插入注射器；另一端插入针头固定座。将注射针插入针头固定座中，确保注射针末端与连接管在针头固定座内的末端直接接触。
4. 手动缓慢推动活塞，使溶液流经连接管，直至注射针尖端出现微小液滴。
5. 小心地将活塞移至推块旁，并用推块支架固定到位。
6. 设定注射参数：注射速率应约为8μl/min（˜130nl/s）；注射体积通常为1–2μl；根据所用注射器的规格选择合适的注射器直径（参见注射泵使用手册中的指导说明）。
7. 将加热板温度设为˜38°C，并覆盖纸巾或其他薄层屏障，以在幼崽恢复期间对其进行保护。

3. 注射操作与幼鼠恢复

1. 根据IACUC批准的方案，通过低温麻醉准备P0或P1小鼠幼崽用于注射。将几张纸巾沾湿后置于冰上。将所需数量的小鼠幼崽（4-5只）放在纸巾上（保持充分分离），然后轻轻将纸巾折叠覆盖在幼崽上方。在纸巾上轻轻放置少量碎冰，将幼崽孵育约5分钟。幼崽可在冰上保持最多15分钟，之后可良好恢复。
2. 当幼崽充分麻醉后，将其放置在固定用的支撑块上（我们使用通常用于固定15 ml离心管的泡沫块），并调整位置以便于接近注射部位。对于大脑皮层注射，最方便的是将动物平趴在腹部；而对于小脑注射，则建议将幼崽头部置于支撑块边缘，以更好地接近颅骨后部。如有需要，可用创可贴将幼崽固定在原位。
3. 一只手固定幼崽头部，另一只手手动将针头插入颅骨目标位置。注射时拉紧皮肤有助于防止其移动。对于皮层注射，建议以明确的解剖标志（如颅骨的人字缝）为参照进行定位，这有助于后续重复注射。小脑可通过颅骨观察到，表现为位于丘脑后方的一条细长组织带。针头插入深度在不同个体和品系间略有差异，可通过针头上预设的刻度标记进行判断；但对于皮层和小脑，我们发现从表面算起约0.5–1 mm的深度通常合适。其他注射位点的插入深度应由最终使用者通过实验确定。
   注意：针头应能轻松穿透颅骨；若无法穿透，请勿用力过猛，以免损伤动物。应重新调整针头位置并轻柔地再次尝试。
4. 注射病毒溶液。根据所用压力注射仪的型号，通过按下泵上的“START”按钮或踩下脚踏开关来启动注射。若无脚踏开关，建议由同事协助按下按钮，以尽量减少可能影响注射效果的额外手部动作。
5. 在注入预定体积后，保持针头静置数秒，然后平稳地轻轻拔出。务必固定幼崽头部以减少不必要的移动。由于注射设备在每次实验之间均使用乙醇清洁和消毒，且创口较小，因此无需使用抗菌剂。
6. 将幼崽放置在温度设定为约38°C的加热板上，以促进其恢复，通常需要5–10分钟。在此期间，可继续对其他幼崽进行注射。
7. 待所有幼崽恢复后（应呈现粉红色并开始活动），取部分原笼垫料轻轻擦拭幼崽身体，随后将它们作为一组归还给母鼠。

注意：在将幼崽放回母鼠之前，必须确保幼崽保持温暖并接触过巢穴垫料，且应将它们成组放回。若不这样做，可能导致母鼠伤害或杀死幼崽。

4. 仪器设备清洁

1. 注射完成后，将幼崽放回母鼠身边，用丙酮或70%乙醇完全充满注射器以清洗注射装置。每次使用新鲜溶液，反复冲洗装置数次。此步骤可清除残留的病毒溶液及沉淀物。丙酮或乙醇随后会自然挥发。
   注意：建议优先使用丙酮进行清洗；但如果装置中含有对丙酮敏感的组件（如氰基丙烯酸酯类胶粘剂），则应改用70%乙醇执行这些步骤。
2. 用漂白剂对工作区域进行消毒，并将废弃物丢弃至适当的生物危害容器中。

5. 分析

1. 使用经 IACUC 批准的安乐死方法在所需年龄处死动物。建议进行灌注固定，以利于后续感染神经元的可视化，尤其是在成年动物中。
2. 可采用标准免疫染色程序以增强荧光信号。简言之，将 100 μm 的游离振动切片在 PBS + 1% Triton X-100 中通透，并在 PBS + 1% Triton X-100 + 10% 正常山羊血清中封闭。切片在封闭液中与一抗于 4°C 过夜孵育，随后进行额外的洗涤和封闭。然后将切片在封闭液中与二抗于室温孵育 2 小时，充分洗涤后贴附于载玻片上，并用抗荧光淬灭封片介质加盖盖玻片。冷冻切片也可用于观察标记的神经元，但内源性荧光可能会丢失。

6. 代表性结果：

成功的注射操作可在注射部位区域实现神经元的高效感染，且不会对动物产生可观察到的组织损伤或其他不良影响。如图1所示，在不同解剖位点注射rAAV8-Cre后，可在Cre报告基因小鼠（ROSA26R）¹²中观察到感染的扩散情况。针对特定区域（如大脑皮层和上丘）的注射通常产生局部感染，向邻近区域的扩散极少（图1A-B）。使用高滴度病毒溶液会增加邻近区域（如海马体）被感染的可能性（图1A）。而使用低滴度病毒溶液进行注射则导致稀疏感染，感染通常局限于注射位点附近，如ROSA26R报告基因小鼠小脑中线处注射rAAV8-Cre所示（图1C-D）。我们观察到，在注射rAAV8-Cre后2天内，ROSA26R报告基因小鼠中即出现基因重组现象，表明感染、基因重组以及报告基因的表达均可在较短时间内迅速发生。此外，我们已成功应用该技术研究在非ROSA位点利用floxed条件等位基因进行基因删除的效果，相关结果将另文发表。

感染的细胞数量应与注射病毒溶液的滴度相关。例如，将两种表达不同荧光蛋白的高滴度rAAV8病毒混合后注射至小脑，可感染大量被不同标记的浦肯野细胞（图2A）。相反，注射低滴度病毒溶液则可实现稀疏感染，有助于单个细胞的可视化观察（图2B）。荧光标记的神经元可直接在新鲜切开的活体组织中观察（图2B），也可进行免疫染色以增强内源性荧光信号，便于后续通过宽场或共聚焦荧光显微镜成像（图2A，图3A-C）。最后，rAAV8能够感染大脑皮层中多种类型的神经元，并对细小突起实现强效标记（图3A-C）。

图 1：在出生后第 0 天（P0）注射 rAAV8-Cre 的 ROSA26R 报告小鼠脑组织中的 LacZ 染色，显示 Cre 重组酶活性及感染部位。

1. 注射高滴度（1×10¹² GC/mL）病毒至皮层和上丘后，P14小鼠脑的宽场矢状面视图显示，使用高滴度病毒更可能导致邻近区域也被感染。
2. P14小鼠皮层注射较低滴度（1×10¹¹ GC/mL）病毒后的矢状切面显示局部感染，扩散范围较小。
3. 在中线处注射低滴度（1×10⁹ GC/mL）病毒溶液的P28小鼠小脑整体观显示，感染稀疏，通常局限于注射部位附近。
4. C)中小脑中线的矢状面视图。注意通常只有浦肯野细胞会被rAAV8感染。

图 2：通过注射高滴度和低滴度表达荧光蛋白的rAAV8实现小脑标记。

1. 感染了两种分别表达EGFP（绿色）和DsRed（红色）病毒的P21小脑矢状切面。使用高滴度的病毒混合物感染大量浦肯野细胞。
2. 来自P14活体小脑的浦肯野细胞，经极低滴度病毒感染后，在解剖完成后立即成像。

图 3：rAAV8-DsRed 对皮层的标记。
P0 时感染 rAAV8-DsRed 的 P21 皮层冠状切片中多种皮层神经元类型的示例。

讨论

本文介绍的新生儿病毒注射方法为研究出生后大脑发育提供了一种简单且快速生成体内嵌合体的途径。该方法可利用目前已有的或通过高通量基因靶向项目正在构建的条件性等位基因⁶。与使用转基因表达Cre重组酶的方法相比，该技术能够更快速地在多种细胞类型中检测基因功能，因为携带条件性等位基因的小鼠可直接用于实验，且整个病毒注射过程从开始到结束可在一小时内完成。此外，通过调整病毒滴度可轻松控制被感染细胞的数量，从而实现对单个神经元的稀疏标记。尽管示例图像中仅展示了神经元形态，但对感染神经元的分析可进一步扩展至许多重要的发育过程，包括轴突和树突的生长、分支与拼接，以及突触发育（如树突棘形态发生）等。

该操作过程中最关键的三个环节是注射位点的定位准确性、注射设备的可靠性以及幼鼠的存活率。第一个方面——准确性——需要通过实践经验来掌握。注射设备的可靠性是指在注射前必须确保设备无堵塞、泄漏或其他问题。最后，只要遵循步骤3.7中提到的注意事项，幼鼠的存活通常不会出现问题。

该方案的一个明显改进是使用表达不同基因的病毒...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
rAAV8-Cre、-GFP、-DsRed	Vector Biolabs	#7060、#7061、定制订单	http://www.vectorbiolabs.com
Harvard Pump 11 Plus	Harvard Apparatus	#702208	（无脚踏开关接口）
视网膜色素上皮注射套件	World Precision Instruments, Inc.	RPE-KIT	包含连接管路、注射针头（36G）和针头夹持器
NanoFil 注射器，100μl	World Precision Instruments, Inc.	NANOFIL-100	包含可重复使用的加样针
D-PBS	Invitrogen	14040-117
GFP 抗体	Aves	GFP-1020
DsRed 抗体	Clontech Laboratories	632496
加热模块	VWR international	97042-610
ROSA26R 小鼠	Jackson Laboratory	003309