颗粒凝集法用于脊髓灰质炎病毒鉴定

摘要

一种利用病毒受体分子的新型颗粒凝集（PA）检测方法 recently developed，可实现对脊髓灰质炎病毒（PV）的快速、简便鉴定。本文将介绍用于PV鉴定的PA检测的操作步骤。

摘要

在全球消灭脊髓灰质炎行动中，实验室诊断通过从急性弛缓性麻痹（AFP）病例的粪便样本中分离和鉴定脊髓灰质炎病毒（PV），发挥着关键作用。在世界卫生组织（WHO）全球脊髓灰质炎实验室网络中，目前分别采用细胞培养系统和实时逆转录聚合酶链式反应（real-time RT-PCR）进行PV的分离和鉴定。在PV被消灭后的时代，简单且快速的鉴定方法将有助于各国实验室对脊髓灰质炎病例进行迅速确认。在本研究中，我们将介绍一种用于PV鉴定的新型PA检测方法。该PA检测利用PV受体（PVR）分子与病毒颗粒之间的特异性且对所有PV血清型均具一致亲和力的相互作用。该方法操作简便（在反应板中一步完成）、快速（反应后2小时内即可获得结果），且结果可通过肉眼观察（观察明胶颗粒的凝集现象）。

方案

1. 维持培养基（MM）和生长培养基（GM）的制备

关于MM和GM的制备，请参见世界卫生组织（WHO）的脊髓灰质炎实验室手册¹。可分别使用添加2%胎牛血清（FCS）和10% FCS的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）作为MM和GM的替代物。

2. 抗PV抗体的制备

1. 通过向每瓶抗PV抗体（1型、2型或3型）中加入水（每瓶0.5 mL）来重悬抗PV抗体（RIVM PV分型抗血清）。将重悬后的抗体溶液（每种0.5 mL）分别加入含有4.5 mL MM的已标记试管中。
   注意：某些批次的抗PV抗体以已重悬形式提供（每瓶0.5 mL）。对于此类批次的抗PV抗体，无需再加水进行重悬。
2. 取等体积的重悬后抗PV抗体混合。对于抗PV1+2、2+3或3+1：取每种重悬抗体1.8 mL混合（1.8 mL + 1.8 mL = 每种混合液3.6 mL）。对于抗PV1+2+3：取每种重悬抗体1.2 mL混合（1.2 mL + 1.2 mL + 1.2 mL = 3.6 mL）。
   注意：PV样本中可能含有不同血清型PV的混合物。为了在含有多种PV的样本中鉴定单一血清型，需使用抗PV抗体混合液（即1+2、2+3、3+1、1+2+3）。
3. 向每种抗PV抗体混合液（1+2、2+3、3+1或1+2+3，每份3.6 mL）中加入其体积1/5的FCS（0.72 mL），使终浓度为18.2% FCS。
   注意：添加FCS的目的是减少抗体引起的明胶颗粒非特异性凝集。
4. 将抗体混合液保存于-20 °C，待PA实验时使用。

3. 致敏明胶颗粒的重建

1. 向试剂盒中提供的一个致敏明胶颗粒小瓶（以冻干粉形式提供）加入1.5 mL的重悬缓冲液。
2. 轻轻敲击混匀。
3. 将重悬后的致敏颗粒置于4 °C保存。重悬后的明胶颗粒在4 °C下至少可保持活性2周，但建议在检测前新鲜配制。

重要提示：
请勿混合使用不同批次的致敏明胶颗粒，因为不同批次的致敏明胶颗粒其非凝集状态下的图像可能存在差异。每次实验应使用同一批次的致敏明胶颗粒。

4. 用于PV鉴定的PA检测

1. 准备一个微量滴定板。为鉴定一个病毒样本，需要5个孔，另加至少一个阴性对照（致敏颗粒不加病毒和抗体，如下第6孔。参见示例中的“无病毒和抗体对照”）。每次检测所需的总孔数为5 × 样本数 + 至少一个对照孔。
   重要提示：
   每次检测中至少应设置一个“无病毒和抗体”对照。一管致敏颗粒大约可用于10个病毒样本的鉴定。
2. 向微量滴定板中每孔加入12 μL抗PV抗体或GM。板孔排列如下（亦见下方示例）。对于不含抗体的样本（第1孔和第6孔），用12 μL GM代替抗PV抗体。
   重要提示：
   若本检测需测试大量PV样本，使用多通道移液器或分配器将有助于此步骤。

   第1孔	第2孔	第3孔	第4孔	第5孔	第6孔
   GM	anti-P1+2+3	anti-P1+2	anti-P2+3	ani-P1+3	GM

3. 向每孔加入12 μL病毒样本。对于不含病毒的样本（第6孔），用12 μL GM代替病毒溶液。
   注：病毒样本通常为感染细胞的培养上清液，一般使用L20B细胞或RD细胞。
   重要提示：
   若本检测需测试大量PV样本，使用多通道移液器将有助于此步骤。

   第1孔	第2孔	第3孔	第4孔	第5孔	第6孔
   病毒样本	病毒样本	病毒样本	病毒样本	病毒样本	GM

4. 将重构后的致敏颗粒溶液从4 °C取出，恢复至室温，并轻轻敲击使颗粒充分悬浮。
   重要提示：
   在通过轻敲实现颗粒完全悬浮后，应立即向板孔中加入颗粒，避免悬浮颗粒沉淀形成非均一溶液。
5. 向所有孔中每孔加入25 μL致敏颗粒。
   重要提示：
   加入致敏颗粒后，应立即将板置于板式混匀器上进行混匀，以启动样本的均匀反应。因此，建议使用分配器加入致敏颗粒，以尽量减少板内各样本之间的操作时间差。
6. 将微量滴定板置于板式混匀器上，混匀30秒。
7. 将微量滴定板放置于室温（15˜30 °C）桌面上的白纸上（便于肉眼观察），静置2小时。
   重要提示：
   在反应过程中及反应结束后，切勿移动板，以免影响结果观察和拍照。所形成的凝集物不稳定，移动板易造成干扰。
8. 拍摄板的照片。
   重要提示：
   照片的局部视图无法为后续结果判读和复核提供充分数据。应拍摄多张照片，完整覆盖所有板孔，并聚焦于各孔的凝集图像。

5. 结果解读

1. 确定阳性与阴性孔。将样本中的凝集现象与无病毒和无抗体对照孔（明胶颗粒沉淀，无凝集）进行比较（图1和图2）。若凝集图像明显区别于无病毒和无抗体对照（无凝集，阴性对照），应判定为阳性；若凝集图像与阴性对照相似，则判定为阴性。对于显示明显但仅为部分凝集的样本，可判定为阳性，但需记录为“阳性（部分凝集）”。
2. 确定PV型别。根据含抗PV抗体的阳性与阴性孔结果，判定PV血清型。结果判读原理类似于细胞培养系统中的中和试验（例如，抗P1+2抗体阳性表明样本中含有3型PV）。

6. 代表性结果

PA试验中PV鉴定的代表性结果如图1所示。所有PV毒株均引起致敏明胶颗粒发生凝集（无抗体样本）。当存在相应的抗PV抗体时，明胶颗粒出现沉淀（无凝集现象），与无病毒且无抗体对照组（阴性对照）相似（例如，在抗P1+2或抗P3+1抗体存在时，PV1(Sabin)不发生凝集）。

图1. 通过PA试验鉴定PV。 使用PV1(Sabin)、PV2(Sabin)和PV3(Sabin)病毒溶液（病毒滴度分别为1.2 × 10⁸ CCID₅₀ / 12 μL、8.2 × 10⁷ CCID₅₀ / 12 μL和3.5 × 10⁷ CCID₅₀ / 12 μL）进行PA试验鉴定。无病毒和无抗体对照显示明胶颗粒沉淀（无凝集，阴性对照）。

图2. 阳性与阴性孔的判读。 PV1(Sabin)、PV2(Sabin) 和 PV3(Sabin) 病毒溶液（病毒滴度分别为 2.4 × 10⁸ CCID₅₀ / 25 μL、1.7 × 10⁸ CCID₅₀ / 25 μL 和 7.3 × 10⁷ CCID₅₀ / 25 μL）被稀释至 1/20 至 1/320，随后取 25 μL 稀释样本在无抗PV抗体条件下进行PA实验检测。

讨论

本PA检测法的独特之处在于使用PVR分子而非抗PV抗体来检测PV 2。这使得致敏的明胶颗粒与PV之间发生特异性相互作用，并且对PV的三种血清型均具有均一的亲和力^3-6。我们采用PVR的免疫黏附素形式（PVR-IgG2a）对明胶颗粒进行致敏，因为单体形式的PVR与病毒颗粒上的单一结合位点之间的亲和力仅为中等水平（解离常数为10^-7˜-8 M）^{7, 8}，而使用PVR-IgG2a致敏后，我们成功观察到致敏明胶颗粒与PV分离株之间发生特异性凝集。由于致敏颗粒具有高特异性和均一的亲和力，PA检测法中PV鉴定的关键因素包括：1）病毒滴度（决定PA检测法能否有效检出PV）和2）凝集反应的判读（决定PV鉴定的准确性）。

通常，脊髓灰质炎病毒（PV）分离株在细胞培养系统中的病毒滴度范围为 10⁶ 至 10⁸ CCID₅₀ / 50 μL。PA 检测法（形成完全凝集）对 1 型、2 型和 3 型 PV 的检测限分别为 1.5×10⁶ CCID

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
致敏明胶颗粒	Fujirebio Inc.		检测试剂盒
重悬缓冲液	Fujirebio Inc.		检测试剂盒
微量滴定板	Fujirebio Inc.		检测试剂盒
抗PV抗体	RIVM