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利用FTA卡片进行禽流感监测：现场方法、生物安全与运输问题的解决方案

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DOI：

10.3791/2832

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2011年8月2日

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1Resource Ecology Group, Wageningen University, 2Section for Zoonotic Ecology and Epidemiology, School of Natural Sciences, Linnaeus University, 3Centre for Wildlife Ecology, Simon Fraser University

本文内容

摘要

通过鸟类自然粪便样本验证并拓展了一种用于保存、检测和测序禽流感病毒RNA的方法。该技术无需维持冷链运输和处理具有感染性的病毒，且可应用于96孔高通量操作体系。

摘要

禽流感病毒（AIVs）可感染包括人类在内的多种哺乳动物1。这些AIVs在其自然宿主中具有高度多样性，几乎携带所有可能的病毒亚型2。人类流感大流行的最初来源均为AIVs3。近年来H5N1疫情暴发期间，已报告多例致死的人类病例。最近，一种与AIV相关的新毒株在人群中迅速传播，引发了“甲型H1N1流感大流行”4。尽管人类的贸易和交通运输活动似乎是高致病性毒株传播的主要原因5，但野生鸟类也在一定程度上促进了病毒的扩散6, 7。然而，所有AIV毒株的实际储存宿主仍是野生鸟类。

针对这一情况，并鉴于家禽行业遭受的重大经济损失，全球已实施大规模监测计划，以收集禽流感病毒（AIV）生态学方面的信息，并建立早期预警系统，用于检测某些高致病性毒株8-12。传统的病毒学方法要求病毒在分析前保持完整并进行培养，这需要在运输过程中配备严格的冷链系统（如超低温冰箱）以及严格的生物安全措施。因此，长期监测通常仅限于少数靠近设备完善实验室的野外站点，偏远地区则难以采样，除非实施后勤上极为复杂的程序。这些问题已被认识到13, 14，并已开始研究替代性的样本保存与运输策略（如使用醇类或胍类试剂）15-17。最近，Kraus et al.18 提出了一种基于特殊滤纸的禽流感病毒样本采集、保存和运输方法。FTA卡片19可在干燥条件下保存RNA20，并在病原体接触时使其失活21。该研究表明，FTA卡片可用于逆转录PCR检测禽流感病毒RNA，所得cDNA可进一步测序，从而确定病毒基因。

在Kraus的研究中 等.18 使用了一株实验室分离的禽流感病毒（AIV），样品均单独处理。本文所述的拓展应用中，直接检测了来自瑞典东南部奥滕比鸟类观测站鸭类陷阱中野生鸟类的粪便样品，以说明该方法在野外条件下的实用性。演示了鸭子的捕捉及通过泄殖腔拭子采集样品的过程。当前方案包括将操作流程从单管处理升级为96孔板设计。尽管敏感性低于传统方法，FTA卡片法仍为大规模监测计划提供了极好的补充手段。该方法允许在全球任何地点采集和分析样品，无需维持冷链运输，也无需遵守危险试剂（如乙醇或胍）运输相关的安全规定。

方案

1. 鸭类捕捉与泄殖腔拭子采样

  1. 利用诱鸭或食物将栖鸭属 Anas（或其他鸟类）诱捕入笼中，随后将其放入单独的纸板箱内。运输时间应尽可能缩短，例如在捕获点附近设立野外工作站。每项研究的后勤条件可能有所不同，任何新的实验设置均需征询并获得相关动物伦理委员会的建议与批准。此外，也可采集猎人猎杀的鸟类样本。
  2. 将鸭子从箱中取出时，应将其双翼紧贴身体固定。大多数情况下，箱底会有新鲜排泄物，可直接采集。使用无菌拭子拾取排泄物，并将液体涂抹于Whatman FTA卡片上。若无排泄物，则进行泄殖腔拭子采样。
  3. 将鸭子翻转至仰卧位，以便接触泄殖腔并便于采样。泄殖腔为位于腹部下方、靠近尾基部的突出结构。有经验的操作者可单人完成固定与采样，或由第二人协助完成。
  4. 小心地将无菌塑料绒毛拭子（Copan, Italy）插入泄殖腔约1 cm，并轻轻旋转。随后将沾有泄殖腔液体的拭子在Whatman FTA卡片表面滚动涂抹。采样完成后应立即释放动物。
  5. 将FTA卡片在室温下干燥至少1小时，然后将每份样本单独存放于纸袋（如信封）中。样本可在室温下保存，若在潮湿气候条件下，可加入硅胶干燥珠。由于病原体在接触FTA卡片表面后即失活，收发机构的生物安全负责人可允许通过普通邮件寄送FTA卡片。

2. 病毒RNA提取

  1. 提取包含粪便/泄殖腔液的FTA卡片材料。使用Harris 2 mm打孔器 punch三个圆片，并将所有圆片放入一个无RNase的96孔板的孔中。每处理一个新样本之间，需用酒精和Kimtech精密擦拭纸仔细清洁打孔器。始终设置阳性和阴性对照。阳性对照可使用新鲜接种于FTA卡片上的实验室毒株，或已知能产生阳性结果的自然样本；阴性对照则从空白FTA卡片上 punch圆片。此外，在实验中另留一个孔用于后续PCR对照（以水作为模板）。
  2. 向每个孔中加入70μl RNA快速提取液（Ambion），并使用AbGene热封仪密封板子。在平板振荡器上室温孵育5分钟，振荡速度应设定为不会引起液体溅出的程度（具体速度取决于所用平板振荡器型号，需提前测试）。
  3. 按照MagMAX-96病毒RNA提取试剂盒（Ambion）的制造商说明书进行病毒RNA提取。简要步骤如下：向每个孔中加入130μl已配制的裂解/结合液（试剂盒提供）。将50μl已提取的FTA卡片材料转移至各孔中。振荡平板1分钟。
  4. 向每个样本中加入20μl已配制的磁珠混合液（试剂盒提供），并通过移液器反复吹打混匀。在设定速度下振荡5分钟。RNA分子将结合至磁珠表面。
  5. 将板子移至磁力96孔架上以捕获磁珠。根据所用磁力架型号不同，此过程可能需要超过5分钟。当溶液完全变澄清后，吸除并弃去上清液。随后将板子从磁力架上取下。
  6. 用洗涤液1（试剂盒提供）洗涤磁珠两次，再用洗涤液2（试剂盒提供）洗涤两次。每次洗涤步骤均向每个样本加入150μl已配制的洗涤液，设定速度振荡1分钟，然后将板子移至磁力架上，捕获磁珠约5分钟（或直至溶液完全澄清），吸除并弃去上清液。随后将板子从磁力架上取下，加入下一种洗涤液，并重复上述洗涤步骤。最后一次洗涤后，尽可能彻底去除洗涤液，并在平板振荡器上室温空气中干燥磁珠2分钟。
  7. 向每个孔中加入50μl洗脱缓冲液（试剂盒提供），在平板振荡器上振荡4分钟以释放RNA。按前述方法捕获磁珠。此时上清液中即含有已纯化的RNA，可直接用于后续实验。

3. 禽流感病毒基质基因的RT-PCR

使用 One-Step Access RT-PCR 系统（Promega）进行 25 μl 反应体系的逆转录 PCR（RT-PCR）（根据 Kraus et al.18 和 Fouchier et al.22 的方法调整）：

无核酸酶水1.5μl
AMV/Tfl5 缓冲液5μl
dNTPs0.5μl
引物 M52C22 (10 μM)2.5μl
引物 M253R22 (10 μM)2.5μl
MgSO4 (25 mM)7μl
AMV 逆转录酶 (5u/μl)0.5μl
Tfl 聚合酶 (5u/μl)0.5μl
RNA 样品5μl

在Biometra T1梯度PCR仪中的扩增条件为：45°C下反转录5分钟，随后在94°C下预变性2分钟，然后进行40个循环：94°C变性1分钟，56°C退火1分钟，68°C延伸2分钟。最后在68°C额外延伸7分钟以完成扩增。

4. 筛选AI阳性样品及从凝胶中纯化目标片段

  1. 取2μl PCR产物，加入2μl 5x上样缓冲液（BioRad）和6μl水，混匀后上样至含1%溴化乙锭（每100 ml凝胶中加入2.5μl）的1%琼脂糖凝胶（Roche）中进行初步筛查。
  2. 在120V电压下电泳1小时，同时使用DNA分子量标准（BioRad EZ load 100 bp ladder），并用凝胶成像系统观察结果。示例见图1。
  3. 选择扩增片段大小在预期范围内（200 bp至300 bp之间，目标片段为244 bp）的样品，将这些样品剩余的PCR反应液（约23μl）全部与6μl 5x上样缓冲液混合后，上样至含溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶，电泳2小时。
  4. 将凝胶置于紫外透射仪（Bioblock Scientific）上肉眼观察。示例见图2。用手术刀切下大小正确的条带，转移至各自的1.5 ml离心管中。使用试剂盒（如Zymoclean Gel DNA Recovery Kit，Zymo Research）从凝胶中纯化DNA片段。

5. PCR产物的测序与鉴定

  1. 对目标片段进行Sanger测序，例如使用ABI 3730毛细管测序仪配合ABI Big Dye 3.1化学试剂（Applied Biosystems）。在10μl反应体系中配制测序反应液，包含10–20 ng凝胶纯化的模板cDNA、1.75μl 5×稀释缓冲液、0.5μl Big Dye V3.1预混液、1 μl正向引物（M52C20，10 mM）以及ddH2O。循环条件为：96°C初始变性1分钟，随后进行25个循环，每个循环包括：96°C变性10秒、45°C退火5秒、60°C延伸4分钟。根据实验室内部方案对测序反应产物进行纯化和后续处理。
  2. 将获得的cDNA序列与GenBank23等核苷酸数据库进行比对分析，例如通过美国国家生物技术信息中心（NCBI，http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）提供的BLAST等在线工具进行比对。

6. 代表性结果：

绿头鸭（Anas platyrhynchos）于2007年12月在中国台湾奥滕比鸟类观测站采样。每只绿头鸭的样本均按照本方案所述方法采集至FTA卡片上。运输后，FTA卡片保存于-80 °C冰箱中20°C 两年。在Kraus实验室分离株测试中使用的同一张FTA卡样本 等.18 作为阳性对照，并对其进行了九个十倍连续稀释。两个阴性对照分别为：i）对空白FTA卡片进行提取，以检测打孔器是否存在交叉污染；ii）以无核酸酶水作为模板进行RT-PCR反应，以检测PCR反应过程中或反应体系准备阶段是否发生污染。

共分析了84个样本。这84个样本的PCR产物凝胶电泳图见图1。由于粪便中存在多种微生物污染，从天然样本中可观察到大量非特异性条带。然而，引物对的目标片段长度为244 bp。将部分产生片段大小在预期范围（200 bp至300 bp之间）的样本的全部PCR反应体系上样进行凝胶电泳（图1）。哪些条带从凝胶中被切下的示意图见补充图1。除阳性对照外，根据新方案，其中两个样本（69899和69912）结果为阳性。对NCBI核苷酸数据库进行BLAST比对分析，结果显示这两个阳性条带的序列与AI基质蛋白基因一致（图3），而其余所有条带最接近细菌序列，或未能获得可读序列。

凝胶电泳结果，DNA条带分离，PCR产物分析，分子生物学示意图。
图1. PCR产物初步筛选的凝胶电泳图。 加样内容包括：2 μl阳性对照PCR产物、阳性对照的系列稀释样本、两个阴性对照以及84个泄殖腔样本。上部凝胶图显示48个样本，下部凝胶图显示另外48个样本。红色箭头指示用于100 bp DNA分子量标准的加样孔。为便于说明，红色圆圈标示出位于预期大小范围内的条带。蓝色圆圈标示非特异性扩增产物（左上）或大小低于100 bp的引物二聚体扩增假象（右下）。

凝胶电泳结果；DNA分离；可见分子量标记；样品鉴定。
图2. 选择片段大小在正确范围内的样品。 选取条带位于200 bp至300 bp之间（目标片段为244 bp）的样品。绿色箭头指示阳性对照，两个红色箭头指示通过将其cDNA序列与NCBI核苷酸数据库比对后确认为禽流感病毒（AIV）阳性的样品。

核苷酸序列比对的BLASTN结果表格，显示物种、E值和一致性得分。
图3. 在NCBI进行代表性BLAST搜索的屏幕截图。 从切下的片段中获得的一个cDNA序列被用于在NCBI网站的核苷酸数据库中进行查询。该样本被正确鉴定为AI基质基因片段。 要查看此图像的完整尺寸版本，请点击此处。

凝胶电泳结果；DNA分离；条带模式；分子量标记物。
补充图 S1. 从凝胶中切取的部分样品条带。 本图片拍摄于图1所示凝胶，其中200 bp至300 bp之间的候选条带已被切出。

讨论

本文所述方案提供了一种用于筛查粪便或类似样本中禽流感病毒（AIV）的补充方法。该方法特别设计为使样本采集快速且简便，从而使受训较少的人员（如猎人或野生动物管理人员）也能够参与禽流感监测工作。该方法无需使用冷链运输，尽管在条件允许时建议对样本进行冷冻保存。只要FTA卡片保持干燥，在室温下放置数天（例如在运输至实验室期间）不会对FTA卡片上的RNA分子造成影响。目前科研界正在评估的其他非冷藏保存系统，如乙醇15或胍16，由于具有潜在危险性，需要特殊的运输安排。相比之下，FTA卡片法无需运输危险材料。然而，另一个值得关注的保存介质是RNAlater™，同样不具有危险性17。样本分析可在任何标准分子生物学实验室中进行，除常规PCR反应和毛细管测序所需设备外，无需其他特殊仪器。所有操作步骤均无需在生物安全等级条件下进行，因为在样本采集时，FTA卡片的抗菌和抗病毒活性已使潜在的病原体失活。

在野生鸟类样本的试验中，未观察到交叉污染及随后的假阳性样本。然而，在处理RNA和PCR时，始终建议特别注意保持工作场所清洁，并将PCR前后的步骤安排在独立的房间内进行。在通风橱中操作可降低实验室中气溶胶污染的风险。移液操作必须使用带滤芯的吸头。

根据之前对同一批鸭子同时采集样本的研究，我们已知84个样本中有6个通过传统的实时逆转录聚合酶链式反应（RealTime RT-PCR）方法检测为阳性24，且这些样本的RealTime RT-PCR的Ct值已知。我们方法检测出的两个阳性样本来自Ct值<30的鸭子（表明病毒RNA浓度较高）。其余四个使用传统方案检测为阳性的样本，其Ct值>30（浓度较低），而我们的检测方案未能检出。

只有病毒滴度相对较高的样本在我们的检测中呈阳性，而该方法的灵敏度可能是未能检出所有阳性样本的原因。此外，本研究的样本量非常小，若开展更多受控且严谨的实验，该方法可得到更全面的开发与评估。然而，如果这些样本来自偏远地区，则根本无法进行传统的分析。另外，这些初步结果来自需要进一步优化的预实验。样本采集后在普通的-20°C冰箱中储存了两年，这可能也影响了病毒RNA的质量。当涉及灭活病毒在室温下储存时，RNA可能发生的降解是一个重要问题。如上所述，储存在其他替代液体中的样本会遭受显著的降解，从而影响对病毒基因组长片段的分析16。尽管本研究未对此进行测试，但已有研究表明FTA卡片非常适合保存与禽流感病毒非常相似的其他RNA体系中的完整RNA分子25, 26。

披露

鸟类的捕捉、处理和取样均遵循国家法律法规，并已获得瑞典农业委员会和实验动物伦理委员会的批准。

致谢

感谢 Bert Dibbits 提供的技术支持。荷兰瓦赫宁根大学动物育种与基因组学研究组慷慨地为我们提供了实验室场地。感谢瑞典奥滕比鸟类观测站的工作人员协助捕获和采集绿头鸭样本，特别是 Magnus Hellström、Marcus Danielsson、Christopher Magnusson 和 Stina Andersson。感谢 Sanne Svensson、Jonatan Qvist 和 Per-Axel Gjöres 在奥滕比进行拍摄，以及 Mano Camon 在实验室的拍摄工作。Daniel Bengtson 为本出版物的视频部分提供了精美的鸭子照片。本作品还使用了美国疾病控制与预防中心公共卫生图像库（PHIL；http://phil.cdc.gov/phil/）提供的免费资料：流感病毒的电子显微照片（编号 280，由 Erskine Palmer 博士拍摄）和插图（编号 11823，由 Douglas Jordan 绘制）。本研究获得了荷兰皇家猎人协会（KNJV）、荷兰农业部、Faunafonds 基金会、Stichting de Eik 信托基金（均位于荷兰）、瑞典研究理事会（项目编号 2007-20774）以及欧盟资助的 Newflubird 项目的资金支持。RNA 提取试剂由 Ambion, Inc（RNA 公司）慷慨捐赠。本文为奥滕比鸟类观测站第 245 号研究成果。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
塑料人造丝干拭子Copan, Italy167KS01
FTA 卡Whatman, GE Healthcare多种可选
Harris 2mm 微型打孔器（带垫板）Whatman, GE Healthcare1154409
无RNase 96孔板Greiner Bio-One652290或同类产品
Kim精密擦拭纸Kimtech75512
RNA快速提取溶液AmbionAM9775
MagMAX-96病毒分离试剂盒AmbionAM1836
一步法Access RT-PCR系统Promega Corp.A1250或同类产品
MP琼脂糖Roche Group1388991001多功能琼脂糖
5x上样缓冲液Bio-Rad随DNA Ladder提供
EZ load 100 bp DNA LadderBio-Rad170-8353或同类产品
1%溴化乙锭Fluka46067或同类产品
1.5 ml离心管Eppendorf或同类产品
Zymoclean凝胶DNA回收试剂盒Zymo Research Corp.D4001或同类产品
ABI Big Dye 3.1测序反应试剂Applied Biosystems或同类产品

参考文献

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