成年斑马鱼肾脏的解剖

摘要

斑马鱼的肾脏含有肾源性和造血性成体干细胞/祖细胞，为在脊椎动物模式生物中研究这些细胞类型及其分化后代提供了极佳的机会。本文展示了一种详细的解剖操作步骤，使研究人员能够识别并手术切除成年斑马鱼的肾脏，该组织可用于细胞分离、移植以及肾脏和/或血细胞群体的表达研究等应用。

摘要

成体干细胞生物学这一新兴领域的研究人员致力于探究在正常稳态及疾病状态下调控干细胞行为与功能的信号机制。对成体干细胞的理解将对未来再生医学的发展产生深远影响¹例如，更深入地了解成体干细胞生物学可能有助于设计治疗策略，以诱导器官自我修复，甚至推动开发出器官体外培养的方法 体外 可移植到人类体内的¹斑马鱼已成为研究脊椎动物细胞生物学的强大动物模型²对斑马鱼胚胎发育已有大量文献记载和分析³直到最近，科学家才开始致力于记录成体解剖结构及外科解剖技术⁴，因为斑马鱼研究领域正逐步推动这一研究模式生物在成体研究中的应用拓展。例如，目前对利用斑马鱼研究成体干细胞群体的生物学特性，以及构建复杂的成体疾病模型（如癌症）的兴趣日益增长⁵历史上，斑马鱼成体肾脏的分离对于研究造血作用至关重要，因为肾脏是鱼类血细胞生成的解剖学部位。^6,7肾脏由呈树枝状排列的肾单位功能单元组成，其间的空隙中分布有造血组织。该造血成分包含定植于肾脏内的造血干细胞（HSCs）及其子代细胞，直至它们完成终末分化。⁸此外，目前人们认识到，一组肾干细胞/祖细胞（RPCs）也存在于斑马鱼肾脏器官中，能够实现肾脏的再生和生长，这与其他鱼类物种中观察到的现象相似。^9-11鉴于这一新发现，斑马鱼肾脏是成体干细胞生物学研究中两个极具前景的研究方向的所在器官。显然，许多悬而未决的科学问题均可借助这一实验系统得到良好解答。为了推动该领域的发展，有必要详细记录可视化并分离成体斑马鱼肾脏器官的实验方法。本方案详述了从未经固定和已固定的成体斑马鱼中解剖肾脏器官的操作流程。 肾脏器官的解剖可用于分离和鉴定造血干细胞、肾源性干细胞及其子代细胞，结合组织学、荧光激活细胞分选（FACS）等成熟技术进行分析。^11,12表达谱分析^13,14和移植^11,15我们希望本实验方案的传播能够使研究人员掌握相关知识，从而更广泛地开展斑马鱼研究，并最终将其成果转化为人类应用。

方案

1. 从未经固定的成年斑马鱼样本中解剖肾脏

1. 选择一条年龄在3至6个月之间的成年斑马鱼用于解剖。
2. 将鱼放入含有0.2% Tricaine（pH 7.0）的培养皿中，持续约4-5分钟以实施安乐死，期间需仔细观察，确保鳃部停止运动且心脏停止跳动。
3. 使用勺子将鱼连同少量溶液从Tricaine溶液中取出，倾去溶液后，轻轻将鱼体置于纸巾上。
4. 使用锋利的解剖剪，在鳃盖骨后方稍作切割，移除鱼头（图1，路径A）。将鱼头丢弃至生物危害废物容器中。
5. 用解剖剪沿腹侧做一长切口，从头部开始，延伸至尾鳍基部（图1，路径B），以打开鱼体体腔。
6. 使用解剖镊子/钳子取出鱼的内脏器官，并将其放入生物危害废物容器中。注意避免触碰背侧体壁，因为肾脏位于此处（图2）。若选择的是雌鱼，则需将体腔中正在发育的卵取出，使用带角度的镊子或钳子操作最为方便。
7. 使用解剖针将体壁固定在解剖托盘上并展开，调整针的角度以便观察肾脏。肾脏具有特征性的形态（头部、躯干/马鞍部、尾部）和颜色，其间分布有黑色色素（图2）。你可能还会看到沿器官结构中线走行的主动脉，其中含有外周血液。
8. 使用精细镊子从背侧体壁上分离肾脏，一手用镊子提起肾脏，同时将器官与其下方的结缔组织分离。
9. 将肾脏轻柔地转移至所需的介质中，用于后续活细胞研究，例如置于含有1x PBS的微量离心管中，以备FACS制样之用。

2. 固定成年斑马鱼样本的肾脏制备与解剖

1. 配制 4% 多聚甲醛/1× PBST 溶液。加热煮沸使多聚甲醛完全溶解，随后将溶液冷却至 4°C 并加入0.1%二甲基亚砜。在组织保存方面，我们发现使用新配制的PFA溶液比使用冷冻分装的溶液效果更佳。配制足够量的溶液，以确保在解剖过程中能够完全浸没成年斑马鱼。
2. 在解剖托盘中加入足量固定液，以完全浸没成年斑马鱼。后续步骤在显微镜下进行，可将托盘置于通风橱内，以减少接触固定液气味。
3. 选择一条年龄在3至6个月之间的成年斑马鱼进行解剖。
4. 将鱼放入含有0.2% Tricaine（pH 7.0）的培养皿中约5分钟，以实施安乐死，密切观察直至鳃和心脏停止跳动。
5. 用勺子将鱼从三卡因溶液中连同少量溶液一起捞出，倾去溶液，然后轻轻将鱼放在纸巾上。
6. 使用一把锋利的解剖剪，在鳃盖后方沿图1中路径A所示位置剪下动物头部。将头部弃置于生物危害废物容器中，并立即将动物放入含有PFA的解剖托盘中。
7. 使用解剖剪在动物体表做一条从头部开始、延伸至尾部尾鳍基部的长腹侧切口（图1，路径B），以打开动物体腔，并在操作过程中保持身体部分浸没。
8. 使用解剖镊/钳子取出动物的内脏，并将其放入生物危害废物容器中。注意不要触碰背侧体壁，因为肾脏位于此处（图2）。
9. 使用解剖针将体壁展开并固定，针的角度应便于观察肾脏。肾脏具有特征性的形态（头、鞍、尾）和颜色，其间分布有黑色色素沉着（图2）。你还可以看到位于器官结构中线、充满外周血液的主动脉。
10. 过夜固定样品，将托盘置于 4°C 完成所需样本的排列后。
11. 第二天，从托盘中移除PFA溶液，并替换为1x PBST。
12. 使用精细镊子小心地将肾脏从体壁背侧分离，用一对镊子提起肾脏，同时将其与下方的结缔组织分开。由于固定液中的DMSO作用，肾脏组织会变得柔软且富有弹性，因此可以完整地将整个肾脏器官以单一块状进行解剖。
13. 使用宽口移液管将肾脏放入微量离心管中。
14. 肾脏现在可进一步处理，用于组织学或整体装片分析 原位 根据所需研究开展的基因表达研究

3. 代表性结果：

图1中所示的步骤为解剖流程。根据肾脏的典型形态、颜色及其在动物体腔背壁上的解剖位置，可识别肾脏，如图2所示。固定肾脏样本解剖后，进行整体封片 原位 杂交可用于定位目的基因的表达，如图3所示。

图 1：实现直接暴露成年斑马鱼肾脏的解剖操作流程。（A） 对已处死的斑马鱼进行逐步解剖（以数字和箭头指示），以便研究者最便捷地暴露完整的肾脏器官。腹部腔体在移除腹腔器官前 （B） 和移除后 （C） 的图像。

图 2：未固定样品中斑马鱼肾脏的可视化。 在移除体腔内的器官后，肾脏呈现为一个单一的扁平器官，通过结缔组织附着于背侧体壁 (A)，并已进行示意图化 (B) 以展示其解剖形态。

图3：整体装片 原位 在成年肾脏器官整体上进行的杂交。(A) cadherin17 在成年肾脏肾单位的肾小管中检测到转录本，其表达范围扩大 (A’). （B） mafba 转录本定位于成年肾脏的近端肾小管细胞类型（与A图中的整个肾小管相比）。 (B’) 放大的视图 mafba 表达分析显示，转录本特异性定位于足细胞 (P) 肾小球（滤过血液的结构）和近曲小管（PCT）的细胞。

讨论

成体干细胞是维持成年个体体态的动态且关键的组成部分¹。成体干细胞还可用于对抗机体在疾病状态下所遭受的损伤，而其功能障碍或缺失可导致器官功能衰退，并被认为与癌症恶性进展及衰老过程相关。成体干细胞具有一系列区别于已分化细胞类型的细胞特性。在细胞分裂过程中，成体干细胞能够进行自我更新，并产生祖细胞，后者可进一步分化为多种不同的终末分化细胞。由于成体干细胞在组织稳态中发挥重要作用，科研人员对其调控细胞命运决定和分化潜能的信号通路具有浓厚兴趣¹。例如，目前许多科学家致力于鉴定维持不同成体干细胞群体在其生态位（即特化的微环境）中功能的信号分子，以及体液因子如何影响这一生态位。

成体造血干细胞（HSCs）是一类具有多向分化潜能的细胞，能够持续驱动动物体内血细胞的更新⁸。造血过程在脊椎动物整个生命周期中持续进行，是一个高度活跃的生理活动，因为成熟的终末分化血细胞寿命较短，必须不断被补充。HSCs通过自我更新并产生一系列祖细胞，从而满足这一关键需求，这些祖细胞进一步分化为红系、巨核细胞系、淋巴系和髓系细胞谱系。这些不同类型的血细胞在循环系统中执行各自独特的功能，包括为组织提供气体交换、通过形成血凝块修复血管损伤，以及抵御病原体入侵的防御机制。尽管HSCs已被发现多年，但关于这些神奇细胞仍有许多引人入胜的问题尚未解决。近年来的研究已鉴定出具有不同长期自我更新能力的HSC亚群，并逐步阐明了调控HSC行为的微环境组分及其信号通路⁸。基于其遗传和分子特性，斑马鱼现已成为造血研究范式中的核心模型之一⁸。利用斑马鱼开展的研究揭示了与哺乳动物等高等脊椎动物保守的HSC生物学新机制，凸显了鱼类血液研究在生物医学领域的重要意义⁸。

从历史上看，关于造血干细胞（HSCs）的研究为探索其他器官是否也由成体干细胞维持的科学征程奠定了基础。目前人们已认识到多种成体干细胞群体的存在，其分布范围广泛，涵盖从大脑到肠道、皮肤以及骨骼肌等多种组织结构。干细胞领域的持续研究致力于揭示成体干细胞甚至某些已分化细胞类型在不同环境下如何表现出更强的分化潜能。

关于肾脏，肾病学领域对于肾脏干细胞是否存在一直存在广泛争议¹⁶。已有独立研究记录了哺乳动物肾脏中存在具有不同程度再生潜能的细胞群体，但目前尚未对这些研究结果形成统一的认识。有趣的是，有强有力的证据表明，许多鱼类物种拥有能够有效促进受损肾单位再生的细胞，并且在成体阶段还能生成全新的肾单位⁹。近期研究已鉴定出斑马鱼成体肾脏干细胞的分子特征^10,11，并证实了这些所谓的肾脏干细胞/祖细胞（RPCs）具有自我更新的能力¹¹。未来仍需进一步研究以确定哺乳动物中是否存在类似的肾脏细胞。然而，持续深入探究调控鱼类RPCs的细胞与分子机制，可能为如何激发哺乳动物肾脏的再生能力提供重要线索。显然，关于RPCs仍有许多未解之谜，而目前斑马鱼研究者所拥有的多种研究工具可被用于解决这些引人入胜的科学问题。

在本实验方案中，我们描述了用于解剖鉴定和分离成年斑马鱼肾脏的方法。也可采用其他步骤来解剖肾脏，例如使用解剖剪通过腹部切口打开腹腔；然而，当我们将腹壁固定张开并移除头部时，最能成功获取完整的肾脏。希望分离并研究这些细胞类型的血液学与肾脏研究者均可采用任一种解剖方法。需要注意的是，我们所描述的成年斑马鱼肾脏分离与操作方法，绝不仅限于致力于成体干细胞生物学问题研究的科学家，因为该器官的解剖可为从事从生理学到衰老等广泛课题研究的科研人员提供支持。此外，该方法可与其他技术（如转基因技术）相结合，从而在分子水平上标记、进而纯化并研究来自野生型或基因突变型斑马鱼的特定血液或肾脏细胞亚群¹¹。展望未来，对干细胞及前体细胞类型进行精细纯化，对于理解其行为调控机制至关重要，因为移植或前体细胞培养等功能性实验正是定义这些细胞潜能与身份的基础。近年来造血前体细胞培养技术的进步开辟了许多新的研究途径，并可能被调整用于肾脏细胞群体的培养¹⁷。斑马鱼化学遗传学已在多种背景下成功鉴定了调控造血干细胞（HSCs）和肾脏前体细胞的信号通路^18-20，未来仍将是与上述细胞生物学技术联合应用的有力研究手段。综上所述，利用斑马鱼模型在血液学与肾病学领域已取得多项突破性成果，未来在这些领域的持续研究有望带来进一步的变革性认知。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
解剖剪	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5882
解剖镊	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5010
解剖弯头镊	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5058
三卡因	Sigma-Aldrich	E10521
多聚甲醛	Electron Microscopy Sciences	19210