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方法文章

镧系配合物的制备、纯化及表征：用于磁共振成像对比剂的研究

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DOI：

10.3791/2844

⸱

2011年7月21日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Wayne State University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们展示了镧系金属配合物的金属化、纯化及表征方法。此处描述的配合物可与大分子偶联，从而通过磁共振成像实现对这些分子的示踪追踪。

摘要

基于聚氨基聚羧酸配体的化合物常用于螯合镧系金属离子，所形成的配合物可作为磁共振成像（MRI）的对比剂。许多市售配体特别适用于此目的，因其含有可实现快速、高纯度、高产率偶联的官能团，可通过胺反应性活化酯和异硫氰酸酯基团，或巯基反应性马来酰亚胺，将配体与大分子及生物分子进行偶联。尽管在生物偶联化学领域，此类配体的金属化反应被视为常规知识，但在选择金属起始原料时，必须考虑金属化操作步骤中的细微差异。此外，存在多种纯化与表征方法可供选择，而最有效方法的选取在一定程度上取决于所用起始原料的选择。这些细微差异在已发表的实验方案中常被忽略。本文旨在演示可用于MRI对比剂的镧系配合物的常见金属化、纯化及表征方法（图1）。我们期望本研究能够帮助生物医学科研人员更便捷地选择起始原料与纯化方法，从而将镧系金属配合物的合成反应纳入其常规使用的反应体系之中。

方案

1. 使用LnCl3盐进行金属化

  1. 将配体溶解于水中，配制成浓度为 30–265 mM 的溶液。本视频中使用的配体为 2-(4-异硫氰酸苯基)-二乙烯三胺五乙酸（p-SCN-Bn-DTPA），其浓度为 73 mM。
  2. 加入 1 M NH4OH 将配体溶液的 pH 值调节至 5.5–7.0 之间。本视频中使用了 0.2 mL 的 1 M NH4OH 溶液。
  3. 将 1–2 当量的 LnCl3 溶解于水中，配制成浓度为 5–1000 mM 的溶液。本视频中 EuCl3 和 GdCl3 的浓度均为 111 mM。通常使用过量金属以推动配位反应完全进行，从而简化后续纯化步骤。
  4. 在搅拌条件下，将 LnCl3 溶液加入配体溶液中。
  5. 加入 LnCl3 后，使用 0.2 M NH4OH 将反应混合物的 pH 值调节至 5.5–7.0 之间。本视频中共使用了 0.5 mL 的 0.2 M NH4OH 溶液。若配体含有对酸敏感的功能基团，建议在此步骤中多次调节 pH 值。注意：若溶液碱性过强，任何对碱敏感的功能基团（如异硫氰酸酯基团）将失活，无法用于后续偶联反应。
  6. 通过 pH 测量监测反应进程。当 pH 值保持稳定时，表明反应已完成。

2. 提高 pH 值的后处理步骤（本视频未包含此步骤，但适用于不含对碱敏感官能团的配体）

  1. 向反应混合物中加入浓氨水（NH4OH），调节 pH 至 ≥11。此步骤将使未配位的金属以不溶性氢氧化物形式沉淀析出。
  2. 用 0.2 μm 滤膜过滤上清液。若反应混合物堵塞滤膜，建议在过滤前先进行离心并倾倒上清液。
  3. 若不进行透析，应在减压条件下除去溶剂（建议使用旋转蒸发或冷冻干燥）。
  4. 若仍有游离镧系元素存在，可重复步骤 2.1–2.3。

3. 透析处理

  1. 根据制造商的说明，将透析管剪成适当长度，以容纳样品体积，并额外预留约样品体积10%的长度。本视频中使用了分子量截留值（MWCO）为100–500道尔顿的透析膜，但如果在金属化之前进行偶联反应，也可根据需要使用更大MWCO的透析管。此外，如有需要，也可使用透析盒替代透析管。
  2. 根据制造商的说明，如适用，将剪好的透析管在室温下浸泡于水中15分钟。
  3. 在透析容器中加入水（透析液）（本视频中使用了1 L烧杯），透析液体积应约为样品体积的100倍。
  4. 将透析管一端折叠两次，并用透析夹夹紧折叠部分。用橡皮筋缠绕夹子末端，以确保透析过程中管口保持封闭。
  5. 将反应混合物经0.2 μm滤膜过滤后，小心地将滤液注入透析管的开口端，注意避免刺破管壁。务必预留足够的顶部空间以便后续封闭透析管。
  6. 将剩余的开口端同样折叠两次，用夹子夹紧，并参照步骤3.4的方法用橡皮筋缠绕固定。
  7. 用橡皮筋将一个装有空气的玻璃小瓶固定在透析管一端的夹子上，再将另一个装有沙子的小瓶固定在另一端的夹子上。这两个小瓶可确保透析管在透析液中始终保持浸没状态。
  8. 将装好样品的透析管放入盛有透析液的透析容器中。
  9. 在室温下使用磁力搅拌器以低速搅拌透析液（避免产生涡流）。
  10. 在一天内更换透析液3次（本视频中分别在2.5、6.5和11.5小时更换），之后继续透析过夜（总透析时间为20–28小时）。
  11. 从透析液中取出透析管，小心打开一端夹子以回收样品。用纯水冲洗透析管内部3次，并将洗涤液合并至样品中。
  12. 在减压条件下除去水分。本视频中采用冷冻干燥法。

4. 游离金属的检测

  1. 将金属配合物溶解于醋酸盐缓冲液中（缓冲液配制：将1.4 mL冰醋酸溶于400 mL水中，用1 M NH4OH调节pH至5.8，加水定容至500 mL），并加入二甲酚橙指示剂（在pH 5.8缓冲液中浓度为16 μM）。在本视频中，将0.3 mg配合物溶解于0.3 mL缓冲液中，并加入3 mL指示剂溶液。
  2. 通过观察指示剂颜色由黄色变为紫色，检测游离金属的存在。
  3. 如需定量测定游离金属含量，可通过绘制标准曲线进行定量1。也可使用染料偶氮胂III替代二甲酚橙2。若仍存在游离金属，应在表征前采用透析、脱盐柱或高效液相色谱法（HPLC）对样品进行进一步纯化。

5. 水配位数（q）的测定

  1. 配制含有 EuIII 配合物（约 1 mM）的 H2O 溶液，以及相同浓度的 D2O 溶液。在分析前，需将 D2O 溶液蒸发并重新溶解于 D2O 中三次，以去除残留的 H2O。
  2. 将水溶液加入洁净的比色皿中，并将比色皿放入荧光分光光度计中。
  3. 进行激发和发射扫描，以确定各自的波长最大值（分别为约 395 nm 和约 595 nm）。
  4. 使用以下参数进行磷光时间衰减实验：激发和发射波长根据步骤 5.3 确定，激发和发射狭缝宽度（5 nm），闪光次数（100），初始延迟（0.01 ms），最大延迟（13 ms），以及延迟增量（0.1 ms）。这些条件适用于大多数配合物，但对于具有极长或极短衰减时间的物种，可相应增加或减少最大延迟和增量值。
  5. 使用步骤 5.1 中制备的 D2O 溶液重复步骤 5.4。
  6. 根据步骤 5.4 和 5.5 获得的发光衰减数据，绘制强度自然对数与时间的关系图。这些直线的斜率即为衰减速率（τ-1）（图 2）。在本视频中，使用 Microsoft Excel 2007 从原始数据生成自然对数图。将衰减速率代入 Horrocks 及其同事推导的公式（公式 1）3 中进行计算。如果配体中含有与金属配位的 OH 或 NH 基团，则必须在使用前对该公式进行修正3。

公式 1：   水中和重水中的静态平衡公式 q 计算；τ 的计算公式。

6. 弛豫率测量

  1. 在弛豫时间分析仪上选择所需的应用模式：T1（纵向弛豫时间）或 T2（横向弛豫时间）。
  2. 制备一系列含有不同浓度 GdIII 配合物的水溶液样品。在本视频中，使用水作为溶剂，配制了浓度分别为 10.0、5.00、2.50、1.25、0.625 和 0 mM 的溶液。也可使用其他水性溶剂或缓冲液，但必须以该溶剂作为空白对照。样品的最终体积取决于所用仪器的具体要求。
  3. 将样品放入仪器中，并静置 5 分钟，使其温度与仪器温度平衡（本视频中为 37 °C）。
  4. 通过调整软件参数，获得平滑的指数曲线，以测定弛豫时间（单位为 s），用于确定 T1 或 T2（T1 和 T2 的代表性曲线见图 3）。
  5. 对所有样品（包括空白样品）重复步骤 6.3 和 6.4。
  6. 计算测得的 T1 或 T2 值的倒数，单位为 s-1。
  7. 绘制 T1-1 或 T2-1 值相对于 GdIII 浓度（单位为 mM）的关系图。由于含 GdIII 配合物具有吸湿性，建议通过原子吸收分光光度法或电感耦合等离子体质谱法确认 GdIII 的实际浓度。对数据点进行直线拟合，代表性图示见图 4。
  8. 拟合直线的斜率即为弛豫率（对于 T1 和 T2 分别记为 r1 或 r2），单位为 mM-1s-1。

7. 代表性结果

本方案各步骤的代表性数据已包含在图表部分。除了本方案中描述的水配位数和弛豫率表征外，还应使用常规化学技术对最终产物进行表征。化合物的结构可通过质谱法确定，图5展示了含GdIII和EuIII配合物的典型同位素分布质谱图。此外，对于不含GdIII的镧系金属配合物，可采用核磁共振（NMR）波谱法进行产物鉴定。为表征配合物的纯度，可采用高效液相色谱（HPLC）或元素分析，或两者结合使用。

化学合成过程示意图，LnCl3配合物的形成与纯化，显示真空去除步骤。
图1. 金属化与纯化的一般方案：示意图展示金属化的一般步骤及选择不同纯化路径的原因。

指数衰减曲线图，ln 强度 vs. 时间，线性拟合，R²=0.99，数据分析结果。
图 2. 发光强度曲线图：来自第 5 节的强度自然对数相对于时间的代表性曲线图。通过水溶液和 D2O 溶液获得的类似曲线所生成直线的斜率，结合公式 1，用于表征含 EuIII 配合物的水配位数。

恢复率与时间关系图；动态响应分析；数据拟合图。
图3. 驰豫衰减时间曲线：（左侧）T1 和（右侧）T2 测定的代表性数据。若曲线形状偏离此模式，将导致数据不可靠。

线性关系图；浓度与1/T1的关系，方程：y=4.33x-0.0129，数据拟合。
图4. 驰豫率测定：1/T1 与 GdIII 浓度关系的代表性图示。拟合直线的斜率为驰豫率，单位为 mM-1s-1。

质谱图，显示质荷比（m/z）与相对强度的关系；峰表示离子分布分析。
图 5. 质谱图：代表性质谱图显示含 GdIII 配合物（左）和含 EuIII 配合物（右）的特征同位素分布模式。黑色高斯峰代表理论同位素分布，红色线条为实际数据。

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讨论

鉴于包含基于镧系元素的对比剂的出版物数量不断增加4-14，在制备、纯化和表征这些产物时必须格外谨慎，以确保结果具有可重复性和可比性。由于镧系配合物具有顺磁性，以及可用于生物偶联的功能基团的敏感性，其纯化和表征通常被认为比有机分子更具挑战性。我们已描述了镧系配合物合成、纯化和表征的常用方法。然而，在选择这些方法之一时，必须考虑所研究的具体体系。

在配位反应中，可使用多种市售的金属盐，具体盐的选择取决于研究目的。例如，使用氯化物（或三氟甲磺酸盐或硝酸盐）盐的优势在于反应对温度的要求相对温和。然而，这些方法需要仔细监测pH值，并会产生盐类副产物。如果所研究的体系对pH变化特别敏感，则必须仔细监测并控制pH值。此外，如果盐类副产物会对所研究的体系造成不利影响，则必须将其去除或采用其他合成方法。使用镧系元素氢氧化物（或氧化物）作为起始原料时，由于这些物质的溶解度较低，必须采用较高的反应温度，但金属化反应的唯一副产物是水。该方法适用于难以脱盐的反应，但不适用于对温度敏感的体系。还值得指出的是，这些金属化反应在金属和配体的浓度方面具有极强的耐受性。第一部分列出的浓度范围涵盖...

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披露

未声明任何利益冲突。

致谢

我们衷心感谢韦恩州立大学提供的启动资金（MJA）、美国衰老研究基金会的资助（SMV），以及美国国立卫生研究院下属国立生物医学成像与生物工程研究所颁发的独立研究职业过渡奖（R00EB007129）（MJA）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
EuCl3∙6H2O西格玛-奥德里奇203254-5G
p-SCN-Bn-DTPAMacrocyclicsB-305
氢氧化铵EMD MilliporeAX1303-3
Spectra/Por 生物技术纤维素酯 (CE) 透析膜 - 分子截留量 500 D费希尔科技68-671-24
Millipore IC Millex-LG 滤器单元费希尔科技SLLG C13 NL
二甲酚橙四钠盐Alfa Aesar41379
乙酸Fluka49199
D2O剑桥同位素实验室DLM-4-25
纯水仪ELGAPurelab Ultra
高效液相色谱-质谱联用仪岛津公司LCMS-2010EV
弛豫时间分析仪布鲁克公司mq60 minispec
紫外-可见分光光度计费希尔科技20-624-00092
冷冻干燥机费希尔科技10-030-133
pH 计Hanna InstrumentsHI 221
荧光分光光度计Horiba Instruments IncFluoromax-4
Molecular Weight Calculator 版本 6.46，作者 Matthew Monr–，2009 年 10 月 17 日下载figure-materials-1 http://ncrr.pnl.gov/software/分子量计算器

参考文献

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