人类急性肾损伤（AKI）是一种常见的临床问题，由构成肾脏肾单位的上皮细胞受损引起，其死亡率高达50-70%1。上皮细胞破坏后，肾单位的再生能力有限，而调控这一现象的机制和限制因素目前仍不清楚。在本视频文章中，我们介绍了在斑马鱼胚胎肾脏（即前肾）中对肾单位细胞进行靶向激光消融的技术。我们的新方法可用于补充由肾毒性诱导的AKI模型，并高分辨率地解析与肾单位上皮再生相关的细胞与分子变化。
本文内容
摘要
摘要
急性肾损伤（AKI）的特征是在数小时至数天内肾功能急剧恶化，最终导致肾衰竭1。AKI 可由多种因素引起，包括缺血、药物毒性或梗阻性损伤1。这会导致机体无法维持体液和电解质的稳态。尽管 AKI 已被观察数十年，但目前仍缺乏有效的临床治疗方法。引人注意的是，部分 AKI 患者随着时间推移可恢复肾功能，这一神秘现象迄今仅被初步描述1,2。利用哺乳动物 AKI 模型的研究表明，缺血或肾毒素损伤的肾脏中，肾单位小管——即肾脏的功能单位，由一系列特化的上皮细胞区域（节段）构成3——会发生上皮细胞死亡1,2。在肾单位中，近端小管上皮细胞的细胞死亡最为显著。有证据表明，细胞破坏之后会伴随周围上皮细胞的去分化、增殖和迁移，从而完全再生肾单位1,2。然而，关于肾上皮再生机制仍存在诸多未解之谜，包括调控这些事件的信号通路，以及不同个体间肾脏再生能力存在广泛差异的原因。
幼年斑马鱼是研究肾上皮再生的优良模型，因其原肾由与包括哺乳动物在内的高等脊椎动物保守的肾单位组成4,5。由于幼年斑马鱼具有相对透明的特性，可通过荧光技术对斑马鱼幼体的肾单位进行可视化观察6。这为实时成像细胞和分子变化提供了独特的机会，而相比之下，在哺乳动物模型中，由于肾脏是位于体内结构复杂的系统，肾单位无法被直接观察。近期研究采用氨基糖苷类抗生素庆大霉素作为急性肾损伤（AKI）及继发性肾功能衰竭的毒性致病因子：庆大霉素及其他抗生素已被证实可在人类中引发AKI，研究人员已建立方法利用该试剂在斑马鱼中诱发肾损伤7,8。然而，氨基糖苷类毒性在斑马鱼幼体中具有灾难性和致死性效应，这为长期研究上皮再生与功能带来了困难。我们的方法提出采用靶向细胞消融作为研究斑马鱼上皮损伤的一种新工具。激光消融使研究人员能够在特定细胞群体中诱导细胞死亡。可根据细胞的形态位置、功能，甚至特定细胞表型的表达，靶向不同区域的细胞。因此，激光消融将提高研究人员所研究内容的特异性，并可成为揭示肾上皮再生机制的有力新方法。本方案可广泛应用于斑马鱼胚胎中其他器官的细胞群体靶向，以在多种感兴趣的研究背景下探讨损伤与再生过程。
方案
1. 标记斑马鱼前肾近端小管上皮的显微注射操作
本实验采用微注射系统（Harvard Apparatus, PLI90），由空气压缩机（Jun-Air, Model 6-4）提供加压空气，并在体视显微镜工作站（Nikon, SMZ-Zoom 645）上按照制造商说明组装显微操作装置（Narishige 部件 MN151、IP3 和 GJI）。葡聚糖偶联物可被肾小管近端上皮细胞高效内吞，从而实现对该类上皮细胞群体的选择性标记9。
- 暴露于亚甲蓝可增强卵黄囊的自发荧光，使肾小管的观察更加困难。
- 将受精胚胎在28.5°C条件下培养至受精后48–55小时（hpf）的发育阶段。此阶段是进行幼鱼显微注射的理想时期，因为此时易于进行肌肉内注射，且肾脏功能已开始启动。
- 使用精细镊子去除任何未孵化斑马鱼的卵膜。将培养皿中的卵膜碎片冲洗干净，并重新加入30 mL改良E3溶液。
- 为胚胎准备注射用托盘。我们首选的注射模具由1.5%琼脂糖/E3制成，其表面具有三角形凹槽，可将胚胎置于其中以便注射。制备该注射模具时，我们将带有楔形突起的塑料模具（此前已有详细描述11）漂浮于盛有1.5%琼脂糖基底的培养皿中。
- 通过拉针仪制备玻璃显微注射针，具体方法参见《斑马鱼手册》10。简而言之，将玻璃毛细管拉制成针后，在体视显微镜下用精细金属镊子剪断针尖，以获得锐利的尖端。将剪好的针头盖好后存放于培养皿中，并插在橡皮泥上，以保护针尖并防止灰尘积聚。
- 准备用于标记近端小管的注射溶液。将40 kD荧光素偶联葡聚糖（Invitrogen, D1845）溶于蒸馏水中，配制成浓度为1 mg/mL的溶液。
- 为麻醉鱼类，向盛有斑马鱼幼体和30 mL E3溶液的培养皿中加入5 mL 0.2% Tricaine（pH 7.0）。当鱼体不再对触碰产生反应时，即表明已完全麻醉。必须确保鱼类完全麻醉，否则在注射过程中会出现抽搐。
- 使用塑料移液器将麻醉后的鱼转移至注射模具托盘中。将鱼体头部置于三角形凹槽最深部位，并使其侧卧，躯干沿凹槽倾斜侧放置。
- 进行肌肉内显微注射。将剪好的注射针吸取2–3 μL荧光素标记葡聚糖溶液，向躯干体节内注射约1 nL溶液。注射部位应选择体节的上部，并避开卵黄囊延伸部分，以确保显微注射过程不会机械性破坏肾小管结构。
- 将注射后的斑马鱼转移至洁净的培养皿中，并加入改良E3溶液。用新鲜E3溶液冲洗鱼体三次，彻底去除Tricaine残留。用铝箔覆盖培养皿盖子，以避免葡聚糖暴露于光照下，并将鱼体放回28°C培养箱中过夜。
2. 近端小管细胞的靶向激光消融
在此操作中，我们使用带有落射荧光装置的体视显微镜，筛选近端小管被荧光素葡聚糖强烈标记的动物，并选择这些个体进行激光消融。随后，我们使用已连接至复合显微镜（Nikon Eclipse 80i，配备落射荧光附件）的脉冲微点激光系统（Photonic Instruments, Inc），并按照制造商说明进行校准，以执行肾单位细胞的消融。在细胞消融过程中，我们发现使用FITC滤光片效果最佳，因其可使研究人员在明场照明下观察到荧光标记的小管区域。
在进行本操作前，通过将1.5%甲基纤维素溶解于0.02%三卡因/E3溶液中，制备用于消融实验的固定介质。甲基纤维素分装后可于室温下短期保存以备即用，或于4°C长期保存。
- 将含有72小时斑马鱼幼鱼的培养皿中的E3培养液（30 mL）加入5 mL浓度为0.2%、pH 7.0的Tricaine进行麻醉。当斑马鱼幼鱼不再表现出触碰反应时，即表示已进入麻醉状态。必须确保斑马鱼完全麻醉，否则在进行激光消融操作时会出现抽搐。
- 在适当的荧光设置下观察注射后的动物，选择近端小管易于观察的个体。
- 将选定的胚胎转移至含有三卡因的另一培养皿中。动物可在进行细胞消融前麻醉最多30分钟。如果进行评分 >15只动物，等待消融时将其放回另一个含有新鲜改良E3培养基的培养皿中，因为每个细胞的消融过程需要数分钟。
- 进行消融操作时，将一条已麻醉的斑马鱼转移至含1.5%甲基纤维素/0.02%三卡因的小培养皿中，孵育2分钟以在固定介质中清洗胚胎。
- 接着，将胚胎转移至含有1.5%甲基纤维素/0.02%三卡因液滴的玻璃凹面载玻片上。用细探针轻轻调整动物的位置，使其腹侧朝向载玻片，背侧朝上。
- 将载玻片置于复式显微镜载物台上，聚焦于动物的背侧。在聚焦状态下，踩下脚踏开关以消融肾单位细胞。随着肾上皮细胞被消融，可见荧光信号的弥散（图1A）。
- 将消融后的动物样本轻柔转移至12孔板中的一个孔内，用于后续培养。用E3溶液冲洗2-3次，以去除甲基纤维素。
- 注射后，将动物培养至所需时间点，并按照既定的幼年斑马鱼胚胎组织学和分子生物学技术进行所需的分析（图2）。
3. 典型结果：
图1所示数据表明了消融的时间过程。通过肌肉注射葡聚糖偶联物后，近端小管被优先标记。使用葡聚糖-FITC注射以标记肾脏，用于激光消融；消融后的动物在消融后的一个额外时间点再次注射葡聚糖-罗丹明，以重新成像近端小管细胞群。诸如表达分析技术等 原位 杂交可用于分析细胞消融后单个时间点固定样本中的变化，如图2所示。
图1：激光消融后肾小管上皮迅速再生。 （A-C）斑马鱼幼体近端小管在激光消融时（第3天，A图）以及消融后1天或3天（第4天，B图；第7天，C图）期间及之后的细胞变化时间进程。（上图）示意图显示肾单位的位置，其中包含葡聚糖-FITC（绿色）和葡聚糖-罗丹明（红色），（下图）为对照组和激光消融（LA）肾单位的活体图像。
图2：激光消融后基因表达的分析。 在第3天进行激光消融后，对胚胎进行固定并按整体封片法处理 原位 杂交以检测转录本 slc20a1a，标记肾单位的近曲小管节段。（A）未进行激光消融的对照胚胎，（B） tubule 上皮大范围被消融的胚胎，（C） tubule 上皮短区间被消融的胚胎。黑色线条在 A 中标示近端小管的范围以提供参考，蓝色线条在 B-C 图中标示激光消融的范围，* 在 B-C 图中标示对照（未消融）对侧肾单位。
讨论
斑马鱼作为一种模式生物，在科学研究的诸多领域中被广泛应用，其应用范围正在不断扩大6。利用斑马鱼模型系统研究急性肾损伤（AKI）等肾脏疾病已取得重要发现，并将继续成为研究肾脏损伤的良好模型7,8。斑马鱼基因组已完成测序，且已有多种分子实验方案可供使用，这使得利用转基因模型、基因敲降和基因异常表达研究开展复杂的斑马鱼研究变得日益便捷。斑马鱼生命周期短，繁殖数量大，发育阶段明确。此外，斑马鱼的胚胎和幼体阶段在很大程度上是透明的，使得无需解剖即可进行成像研究。在胚胎和幼体发育阶段，斑马鱼具有由两个肾单位组成的前肾，这些肾单位在发育过程中始终可见。斑马鱼前肾的肾单位在结构和功能上均与哺乳动物的肾单位相似，因此是研究急性肾功能衰竭的理想模型4,5。
肾脏对于人类及其他脊椎动物的生存至关重要，是清除体内液体代谢废物的器官。这一清除功能依赖于肾单位过滤血液的能力，随后对滤液进行修饰，以收集需排泄的含氮废物，同时维持体液和电解质平衡。肾单位由一个血液滤过器、上皮小管和引流导管组成。这三个部分在结构和功能上的完整性对肾单位的正常功能至关重要。多种对肾脏的损伤，包括接触肾毒性物质、缺血或尿液流出道阻塞，均可导致急性肾损伤（AKI）1。急性肾损伤的病理常与急性肾小管坏死相关1,2。临床研究表明，继发性肾功能衰竭的死亡率可高达7%-80%，具体取决于肾衰竭的病因和临床背景。然而，随着对AKI病因的快速诊断和及时干预，坏死肾小管的再生已成为恢复肾功能的重要途径。近期的细胞命运图谱研究显示，修复受损肾小管的主要细胞群体是来源于邻近未受损区域的上皮细胞12。这些发现并未排除肾干细胞/前体细胞可能参与该过程的可能性，另有独立研究报告指出，骨髓来源的细胞也可能参与肾脏再生13。显然，仍需进一步研究以更清晰地阐明肾上皮再生的细胞来源。
肾单位再生与发育均涉及细胞在间充质表型和上皮表型之间的状态转换现象。在肾单位发育过程中，间充质祖细胞分化为静止表型，并附着于基底膜以形成管状上皮3。急性肾衰竭后，上皮细胞推测存在迁移现象，这需要其去分化为间充质表型。有趣的是，最近的研究表明，受损肾脏中的间充质细胞表现出与发育过程中间充质细胞相似的表达谱14。已有多种研究报告检测到细胞黏附分子、基质蛋白、细胞因子和趋化因子的变化。在经历假定的间充质向上皮转化后，细胞在基底膜上重新组装，并重启管状上皮功能活动。确定在此过程中起重要作用的基因，仍是本实验室及其他研究团队的研究课题。尽管阐明该过程关键因子的大量工作仍有待完成，但通过对庆大霉素作用效应的研究，该领域已取得显著进展。
考虑到医学中使用的肾毒性化合物普遍存在，由庆大霉素引起的急性肾损伤（AKI）和肾功能衰竭具有重要意义15。庆大霉素用于治疗革兰氏阴性菌感染，但氨基糖苷类药物的使用在10%-25%的病例中会导致急性肾损伤。该药物引发多种负面细胞效应，最终导致大量肾小管上皮细胞发生凋亡或坏死。研究发现，该药物优先结合由megalin和cubilin形成的复合物，该复合物参与内吞作用。这些分子在近端小管上皮细胞中大量存在，但其表达并不局限于这些细胞。通过诱导氧化应激、释放血管收缩因子、耗竭细胞内ATP、造成缺氧、抑制磷脂酶等细胞信号通路，庆大霉素及类似抗生素可导致上皮细胞发生凋亡和坏死。此外，抗生素还可触发肾单位血液滤过结构（肾小球）中系膜细胞的收缩，导致肾小球滤过率下降，从而负面影响肾脏过滤血液的能力。活性氧物质、免疫刺激分子的产生以及磷脂酶的激活在肾单位内产生广泛影响，引发严重的病理变化，最终导致急性肾功能衰竭。
尽管庆大霉素及类似的抗生素研究在肾脏再生研究中曾是并将继续作为重要的工具，但其缺乏解决某些特定问题所需的精确性。本方案中所述的结合斑马鱼与激光消融技术的研究体系，恰好满足了对这种高精度研究工具的需求。激光消融技术可使研究人员在肾小管的特定区域诱导细胞破坏，范围从小面积（2-3个）到大面积（>50-100）细胞群，具有无与伦比的精确性。在本实验方案中，我们采用一种已建立的暴露于葡聚糖偶联物的方法，以特异性标记近端小管上皮细胞群。此外，也可使用在肾小管一个或多个区域表达绿色荧光蛋白的转基因斑马鱼品系。例如，cadherin17:eGFP 转基因斑马鱼在远端小管区域表现出强烈荧光（尽管在近端细胞群中较弱），可用于其他小管节段再生研究。16肾单位的可见性将实现对细胞随时间变化的延时视频记录。当与基因表达研究（如整体装片）相结合时 原位 通过杂交或免疫组织化学技术，研究人员可以随时间检测肾单位中的分子改变。综合这些策略，有望逐步形成对肾上皮细胞受损时所发生事件的更动态理解。
我们激光消融模型的主要局限性在于，它可能仅能部分重现人类急性肾损伤（AKI）中发生的生理条件。通过瞬时物理损伤诱导的细胞死亡与导致细胞坏死的一系列级联事件不同，因此，这两种不同微环境中的体液因子可能并不相同。此外，已有证据表明在肾脏损伤过程中可发生细胞凋亡，但目前尚不清楚激光损伤后是否也会出现此类后果。然而，正如细胞培养是一种适用于回答某些需要高度可控环境问题的工具一样，激光消融也将作为一种高度可控的 体内 急性肾损伤（AKI）模型。因此，通过对斑马鱼肾上皮消融研究获得的见解，有望推动对其他肾脏损伤机制的基本认识，并可能用于开发更优的人类诊断方法。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
我们感谢Wingert实验室成员在急性肾损伤生物学和斑马鱼技术方面提供的有益讨论，以及C. Diep分享其甲基纤维素配方。作者还希望向圣母大学斑马鱼研究中心的工作人员表示衷心感谢，他们为我们的斑马鱼种群提供了出色的持续饲养管理。本研究工作得到了美国国立卫生研究院下属国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所（NIH-NIDDK）资助号DK083512以及圣母大学提供的慷慨的实验室启动资金支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 胚胎培养皿 | Falcon BD | 35-1005 | |
| 解剖镊 | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5010 | |
| 注射针 | Sutter Instrument Co. | BF100-50-10 | |
| 超纯琼脂糖 | Invitrogen | 16500-500 | |
| 40 千道尔顿 (kD) 葡聚糖-荧光素 | Invitrogen | D1845 | |
| 塑料移液管 | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 204, 13-711-23 | |
| 三卡因 | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 甲基纤维素 | Sigma-Aldrich | M0262 | |
| 凹面载玻片 | Fisher Scientific | S175201 | |
| 12 孔板 | Corning | 3512 |
参考文献
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