Caenorhabditis elegans早期胚胎发育的延时显微成像

摘要

本文介绍了一种用于观察线虫秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）胚胎发育早期事件的技术。

摘要

Caenorhabditis elegans 常被用作研究早期发育过程的模式系统。其胚胎具有透明性，且拥有丰富的遗传资源和相对简便的转化操作，这些特性使 C. elegans 成为研究早期胚胎发生的理想模型。基于激光的共聚焦显微镜结合荧光标记技术，使研究人员能够追踪发育中胚胎的特定细胞结构和蛋白质。例如，可利用荧光标记的染料追踪特定细胞器，如溶酶体或线粒体。这些染料可通过显微注射方式导入成虫性腺，从而递送至早期胚胎。此外，也可利用荧光蛋白标签来观察特定蛋白质的定位。本文展示了使用荧光标记溶酶体染料以及荧光标记组蛋白和泛素蛋白的实例。标记的组蛋白可用于可视化DNA，从而确定细胞周期的阶段。GFP标记的泛素蛋白可揭示早期胚胎中泛素化囊泡的动态变化。通过观察标记的溶酶体和GFP::泛素信号，可判断泛素化囊泡与溶酶体之间是否存在共定位。本文介绍了一种向溶酶体染料进行显微注射的技术。转基因品系的构建方法见其他文献（1, 2）。在成像过程中，将胚胎从成虫雌雄同体线虫中取出，置于2%琼脂糖垫上，随后在标准激光扫描共聚焦显微镜或转盘共聚焦显微镜上进行延时显微成像。该方法可实现对早期胚胎发生过程的高分辨率可视化观察。

方案

1. 线虫培养

1. 从线虫遗传学资源中心（CGC）或同行处获取合适的 C. elegans 品系。
2. 将线虫培养于接种了 OP50 菌苔的 NGM 琼脂平板上（3）。对于 GFP 品系的分析，建议在 25°C 下培养。
3. 在进行显微镜实验的前一天，挑选至少 40 只 L4 期幼虫至接种好的平板中，并将平板置于 25°C 过夜培养。这些线虫在实验时将达到年轻成虫阶段。

2. 注射

如果需要观察溶酶体或线粒体等结构，可在成虫可视化之前注射荧光染料。

1. 制备干燥的琼脂糖注射垫。（此步骤可提前一至多天完成）
   1. 制备熔融的2%琼脂糖水溶液。用巴斯德吸管吸取2滴该溶液滴加到一块22×54 mm的盖玻片上。将另一块盖玻片交叉覆盖在液滴上方。为获得合适的厚度，轻压上方盖玻片，使垫片直径约为1.5 cm。静置5–10分钟。
   2. 移除上方盖玻片。将琼脂糖垫置于80°C烘箱中1小时以脱水，或在实验台放置过夜自然干燥。
2. 制备Mitotracker或Lysotracker溶液。
   1. 将荧光染料用卵缓冲液（Egg Buffer）稀释。通常使用1:10稀释的Mitotracker或Lysotracker溶液。
   2. 使用外径1.2 mm的玻璃毛细管制作注射针。用拉针仪拉制注射针。
   3. 使用拉制的巴斯德吸管从针尾部向注射针内灌注稀释后的染料。
   4. 将注射针置于避光、湿润的容器中备用。
3. 注射前准备：显微镜与注射针的设置。
   1. 将注射针安装至注射装置上。本实验所用装置为Narishige直驱式显微操作器，安装于配备微分干涉差（DIC）成像功能的Nikon TE200倒置显微镜载物台上。
   2. 将注射针连接至内径1.2 mm的导管，导管再连接至压力调节器。可使用压缩空气或氮气作为外部气源。将压力调节器设定为20–25 psi。
   3. 在注射垫上滴加2滴重矿物油（石蜡油）。
   4. 将注射垫置于显微镜载物台上，并将注射针插入油滴中。施加压力，检查液体是否能顺畅从针尖流出。施加注射压力并观察液体是否自针尖流出。若无液体流出，需轻轻折断针尖。可通过将针尖轻触注射垫上一小块碎盖玻片来实现断针。确认针尖出液顺畅后，进入下一步操作。
4. 注射操作。
   1. 在观察胚胎前约1小时，使用解剖显微镜将年轻成虫线虫转移至注射垫上的油滴中。转移时使用尖端为铂丝的线虫挑取工具。
   2. 将3–10条线虫排列于垫片表面，使其平躺于其上。为便于注射，建议将线虫平行排列，间距略小于一条线虫体长。线虫置于注射垫后，应迅速操作，尽快完成注射，以防其因干燥而死亡。
   3. 将带有线虫的盖玻片置于注射显微镜的载物台上，聚焦至远端生殖腺管的中央区域（rachis）。使用显微操作器将注射针尖调节至同一焦平面。水平移动载物台，使针尖刺入线虫体内。当针尖进入rachis后，施加压力，使染料混合液充满生殖腺。对注射垫上所有线虫的双侧生殖腺臂均进行注射。
   4. 注射完成后，使用拉制的巴斯德吸管向线虫加入约0.5 ml卵缓冲液（Egg Buffer）。此举可防止线虫因脱水死亡，并助其从注射操作中恢复。
   5. 将线虫置于避光、湿润的容器中，在室温下恢复1–2小时。

3. 观察胚胎用琼脂糖垫的制备

1. 在 Egg Buffer 中制备熔融的 2% 琼脂糖。
2. 用巴斯德吸管将 3 滴熔融琼脂糖滴加到干净的显微镜载玻片上。
3. 将该载玻片置于另外两张载玻片之间，这两张载玻片表面各贴有一层标签胶带，作为间隔物，以确保琼脂糖垫具有合适的厚度。
4. 将另一张干净的显微镜载玻片垂直压在琼脂糖液滴上，向下按压，直至上方的载玻片接触到作为导引的载玻片上的胶带为止。
5. 在准备固定胚胎进行观察前，立即移去上方的载玻片。

4. 胚胎观察的封片

1. 如果尚未对线虫进行注射，请执行接下来的两个步骤；否则跳过这些步骤。
   1. 从前一天准备的培养皿中挑选年轻的成虫线虫。你应该能够在这些年轻成虫体内看到胚胎。
   2. 将5–20条线虫挑至无菌的NGM培养皿上。让线虫在无菌培养皿上爬行数分钟，以去除附着在体表的大部分细菌。
2. 从成虫线虫中获取年轻的胚胎
   1. 在一块18 mm²的玻璃盖玻片中央加入5–20 μl的卵缓冲液（建议使用厚度为1.5的盖玻片）。
   2. 将来自无菌培养皿或注射垫上的线虫转移至卵缓冲液液滴中。
   3. 使用26号皮下注射针头切开线虫。在阴门附近切开线虫体壁，应可见胚胎从体内流出。
3. 将样品置于显微镜载玻片上
   1. 将预先制备好琼脂糖垫的显微镜载玻片翻转，轻轻盖在含有胚胎的盖玻片上。
   2. 若需要进行长时间的时间序列成像，可用凡士林密封盖玻片边缘，以防止干燥。

5. 显微镜观察

1. 寻找合适的胚胎。
   1. 将载玻片放置在显微镜载物台上，使用10倍物镜扫描以找到胚胎。
   2. 要寻找早期胚胎，应寻找正处于完成母源性减数分裂过程中的胚胎。减数分裂期胚胎与后期胚胎的区别在于其尚未发生胚胎缩短现象。（胚胎完成减数分裂后，可在前端观察到细胞膜与卵壳之间存在明显间隙。）
   3. 一旦确定了处于合适发育阶段的胚胎，即切换至更高倍率的物镜，开始记录胚胎发育过程。
2. 成像
   1. 本示例中，我们对表达mCherry::H2B和GFP::Ub标记蛋白的胚胎进行成像，使用的是Zeiss LSM700常规激光扫描显微镜。
   2. 使用63倍、数值孔径1.4的物镜采集图像。采用488 nm和555 nm激光，激光功率设为最低，增益设为最大。每10–15秒采集一次Z轴层扫图像。根据光漂白程度，共采集30–60个时间点。最终的延时视频由Z轴层扫图像经最大投影处理生成。

6. 代表性结果：

图 1. C. elegans 中从受精到第一次有丝分裂的过程。

图 2. 显微注射步骤。

补充视频 1. 减数分裂胚胎中 GFP:泛素与溶酶体示踪蓝的延时视频。点击此处查看视频。

讨论

与精子融合后，受精卵会经历一系列动态事件。这些事件将卵细胞从一个相对静止的细胞转变为快速发育的胚胎。在许多生物体中，细胞质的重排对于建立胚胎极性和卵子激活至关重要。C. elegans 胚胎为观察卵子激活和胚胎发生的早期事件提供了极佳的研究体系。该胚胎透明，且早期发育事件在受精后相对较快地发生。C. elegans 研究人员已构建出多种有用的转基因品系，可表达标记荧光蛋白的早期发育相关蛋白。结合这些品系与RNA干扰（RNAi）或突变体，可形成一个强大的系统，用于解析多细胞生物发育背后的分子通路（5, 6, 7, 8）。本视频文章介绍了一种利用这些工具和技术记录 C. elegans 早期胚胎发育过程中事件的实用方法。

C. elegans 的成熟卵母细胞停滞在减数分裂 I 的前期，并在成年雌雄同体的受精囊中完成受精。受精后，卵母细胞继续完成减数分裂 I 和减数分裂 II 的其余阶段。这些阶段可通过荧光标记的组蛋白 H2B 进行观察（5）。在母源性减数分裂完成过程中，精子 DNA 保持凝缩状态（见图1）。减数分裂完成后，母源和父源 DNA 解凝缩，形成两个原核。母源原核向父源原核迁移，并在胚胎中央附近融合。原核融合后迅速进入有丝分裂。所有这些事件均在不到一小时内完成。因此，对该事件序列进行延时显微成像可轻松实现。该技术的实施需要具备线虫培养的相关技能、基本的显微镜操作能力，并能够使用共聚焦显微镜。

此处展示的示例利用了一种转基因 C. elegans 品系，该品系表达两种荧光蛋白：GFP::泛素和 mCherry::H2B。采用共聚焦激光扫描显微镜观察这两种蛋白的动态定位。此外，我们还展示了注射荧光标记的溶酶体示踪剂（Lysotracker）可用于追踪受精后胚胎中溶酶体的命运。标记示踪剂的注射也可用于线粒体或局部钙离子浓度的可视化（9）。理论上，该注射方案可用于观察胚胎中任何类型的荧光标记分子，包括标记的小分子、蛋白质、脂质等。在某些情况下，可能无需实际注射标记示踪剂，因为线虫可直接摄取某些染料（如 mitotracker）（10）。然而，我们比较了溶酶体示踪剂的浸泡与注射两种方法，发现注射在胚胎可视化方面效果更佳。

技术注意事项：

该实验操作面临的技术挑战包括显微注射技术以及对早期胚胎进行成像的困难。关于显微注射，琼脂糖注射垫的厚度对注射成功至关重要。如果垫层过厚，线虫会迅速脱水死亡；如果垫层过薄，线虫在注射过程中将无法牢固粘附于垫上。

早期胚胎可能对环境条件（如温度和缓冲液条件）敏感。野生型胚胎应在完成减数分裂II后约一分钟内启动精子DNA的去凝集和原核迁移（4）。在20分钟内，应开始第一次胞质分裂。如果胚胎在制片过程中暴露于过高的激光强度，或过热、受压，该过程可能会受到干扰。此类胚胎将停止发育。若发生此情况，应降低激光功率或使用更厚的琼脂糖垫重复实验。

秀丽隐杆线虫 胚胎在受精后不久才开始分泌卵壳。在受精至卵壳分泌完成之间的短暂时间内，胚胎无法在母体外存活（11）。一些实验室通过直接对胚胎进行成像来规避这一难题 在子宫内 (5, 12). 在子宫内 成像技术具有某些优势，例如能够捕捉受精期间或刚受精后发生的事件。然而，该技术需要使用能够实现深层组织成像的显微系统。双光子或多光子系统尤其适用于此类成像（13, 14）。当使用传统的激光扫描或转盘共聚焦显微镜时，最佳图像通常来自按照本文所述方法从成年蠕虫中分离出的胚胎。

成像系统注意事项：

所使用的共聚焦成像系统的类型取决于用户的需求。通常，如果希望获得尽可能高分辨率的图像，建议使用激光扫描系统。另一方面，由于转盘系统具有较快的图像采集速度，并且光漂白和光毒性较低，因此更适合用于观察高度动态的过程。

具体的成像参数将根据实验设计和所使用的共聚焦成像系统而有所不同。在多维成像中，需要考虑采集的通道数、焦平面数以及时间点数。由于光漂白和光毒性效应的限制，任何特定实验中可获取的图像数量都是有限的。因此，如果选择增加采集的通道数量，则可能需要相应减少焦平面数和/或时间点数，反之亦然。能够采集的图像总数还受到所观察荧光分子的强度以及所用共聚焦显微镜灵敏度的影响。荧光信号越强、仪器越灵敏，所需的曝光时间就越短，从而产生的光漂白和光毒性也越低。

市面上有多种成像系统可供选择。我们将详细介绍在我们自己的实验室中所使用的系统。在利用转盘共聚焦显微镜对线虫胚胎进行成像时，我们采用配备60倍/1.4数值孔径（N.A.）Plan Apo物镜的尼康TE2000U倒置显微镜。该显微镜连接了Yokogawa CSU10转盘单元、Hamamatsu C9100-13 EM CCD相机，以及Spectral Applied Research公司的LMM5激光合束模块，后者包含四个固态激光器，输出波长分别为405 nm、491 nm、561 nm和655 nm。利用该系统，我们可以采集一个或两个通道、6至12个焦平面、25至50个时间点（时间间隔为30至60秒）。典型的曝光时间为100至200毫秒。

对于使用激光扫描共聚焦显微镜成像胚胎，我们采用配备两个通道和四类固态激光器（405、488、555 和 635 nm）的蔡司 LSM700 系统。该系统连接至蔡司 Axio Observer 倒置显微镜，并使用 Plan-Apo 63X/1.4NA 物镜进行胚胎成像。系统通过蔡司 ZEN 软件进行图像采集，该软件同时提供有限的图像处理与分析功能。在使用两种荧光染料成像时，通常采集 1 至 5 个焦平面（间距约 0.5 μm），并每 15 秒收集一次 Z 轴层扫图像。采集持续进行，直至发生明显的光漂白现象。为生成最终的延时视频，使用 ZEN 软件中的最大投影工具对 Z 轴层扫图像进行合并。视频以 avi 文件格式从软件中导出。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
卵缓冲液			5 mM Hepes pH 7.2, 110 mM NaCl, 4 mM KCl, 5 mM Mg 乙酸盐, 5 mM CaCl2
Mitotracker	Invitrogen	M-7512
Lysotracker	Invitrogen	L-7525
注射毛细移液管	Harvard Apparatus	GC120F-10
拉针仪	Kopf Instruments	Model 700C
显微注射装置	Tritech Research, Inc.	MINJ-1 microinjection regulator