大鼠脑切片中GABA激活的单通道电流和紧张性电流

摘要

我们采用膜片钳技术来测量GABA激活的单通道电流（GABAA通道，GABAA受体）及其在神经元中产生的突触电流和紧张性电流。通道的激活可降低神经元在健康和疾病状态下的兴奋性^1,2,3,4。

摘要

GABA_A 通道存在于所有神经元中，分别位于突触内和突触外区域，介导产生时相性和紧张性电流 ^4,5,6,7 GABA_A 通道是一种五聚体GABA门控氯离子通道。该通道亚基分为8个家族（α1-6、β1-3、γ1-3、δ、ε、θ、π和ρ）。由两个α亚基、两个β亚基和一个γ3亚基组成。^rd 亚基构成功能性通道 ⁸结合对亚型特异性GABA激活的单通道分子的研究与包含所有GABA受体群体的研究_A 神经元中的通道，就有可能理解神经元抑制的基本机制以及药理学物质如何调节这一过程。

我们采用膜片钳技术^9,10研究海马脑片中活神经元GABA_A通道的功能特性，并记录单通道电流和全细胞电流。我们进一步探讨不同GABA浓度、其他药物以及细胞内外因素对这些通道的影响。有关膜片钳方法的详细理论与实践描述，请参见B. Sakman和E. Neher主编的《单通道记录》¹⁰。

方案

1. 脑切片的制备：

实验采用出生后16至22天的Wistar大鼠海马脑切片进行。

1. 根据当地伦理准则和批准的动物护理方案，通过断头法处死动物。
2. 用解剖刀迅速取出脑组织，并沿中线用手术刀片（#24）切开。将每个半脑切面朝下放置在Whatman滤纸上。
3. 在样品盘上滴一滴超级胶水，将半脑切面朝下置于其上。将样品盘放入已充满冰冻人工脑脊液（ACSF，详见下文3.1）的振动切片机切割室中。
4. 设置切片厚度为400 μm，开始切脑。在到达海马体之前，需要切除约2 mm的脑组织。
5. 将海马体切片放入盛有ACSF的玻璃培养皿中。将培养皿置于黑色背景（如黑色纸张）上，以便清晰观察海马体。使用锋利的手术刀片将海马体从周围组织中分离出来，注意避免推拉组织。
6. 切片随后在37.0 °C的ACSF溶液中孵育1小时，之后于室温保存直至进行实验。在1小时的孵育过程中，组织可从切割造成的损伤中恢复。

2. 制备用于膜片钳的移液管：

1. 移液管由硼硅酸盐玻璃毛细管制成。
2. 采用自动或手动移液管拉制仪拉制膜片移液管，当使用适当的移液管溶液填充，并以人工脑脊液（ACSF）作为浴液时（见下文3.1），全细胞记录用移液管的电阻为 2 – 4 MΩ，单通道记录用移液管的电阻为 8 – 20 MΩ。
3. 我们用于单通道记录的移液管通过微熔炉进行抛光处理，利用铂丝上熔融玻璃产生的热量使移液管表面更光滑。该熔融玻璃与膜片移液管所用的硼硅酸盐玻璃相同，用于在铂丝上形成玻璃液滴。根据我们的经验，与使用未包被铂丝加热或自动拉制仪中的抛光步骤相比，该方法抛光后的移液管能形成更稳定且更高电阻的封接。移液管最终电阻范围为 8 至 20 MΩ。全细胞记录所用移液管不进行抛光处理。

3. 实验中使用的溶液：

单通道记录和全细胞记录使用特定的溶液。

1. ACSF（人工脑脊液）包含（单位：mM）：124 NaCl、26 NaHCO₃、3 KCl、1.3 MgSO₄、2.5 Na₂HPO₄、2.5 CaCl₂、10 葡萄糖，当用95% O₂ 和5% CO₂ 混合气体饱和时，pH值为7.2–7.4。ACSF有时还会补充其他营养物质，例如乳酸¹¹。
2. 单通道记录：灌流液为ACSF或（单位：mM）：140 NaCl、5 KCl、1 MgCl₂、1.8 CaCl₂、10 TES（N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸），pH 7.25，以及根据特定实验需要添加的其他药物。玻璃微电极内液用于细胞贴附和膜内面向外记录（单位：mM）：140 氯化胆碱、5 NaCl、1 KCl、1 MgCl₂、1.8 CaCl₂、10 TES，pH 7.25，200 μM 沙可洛芬（GABAB受体拮抗剂）以及0–1 μM GABA。用于膜外面向外记录的溶液（单位：mM）：140 NaCl 或氯化胆碱、0.3 KCl、2 MgCl₂、0.5 CaCl₂、5 EGTA、10 TES，pH 7.2–7.4。
3. 全细胞电压钳记录：灌流液：脑片以2–3 ml/min的速度灌流ACSF，其中额外添加犬尿酸（3 mM）以及根据特定实验需要的其他药物。玻璃微电极内液（单位：mM）：140 CsCl、1 CaCl₂、3 EGTA、0.5 KCl、1 MgCl₂、2 ATP-Mg、0.3 GTP-Na、5 QX-314溴化物、10 TES，用CsOH调节pH至7.25。

4. 膜片钳实验中形成吉欧姆（GΩ）密封：

海马脑片（图1A）通过U形铂丝上的尼龙线固定在记录室底部。为了观察组织结构，例如海马脑片中的CA1、CA3以及齿状回区域，或特定细胞，需要使用显微镜。大多数实验室使用直立显微镜，配备10X至60X的物镜，从而能够识别组织中的特定区域或单个细胞。然而，在进行膜片钳记录时，即使使用解剖显微镜也可完成，此时可凭视觉识别待记录的区域，但无法分辨具体细胞。此类记录方式称为“盲法膜片钳”。在这两种情况下，最终都是对特定区域内的单个细胞进行记录。两种方法的成功率相似。尽管海马主要神经元的胞体排列成高度有序的层状结构（例如CA3/CA1锥体细胞层，在海马脑片中表现为明亮条带），但在海马各亚区和各层中零星分布着抑制性中间神经元的胞体，约占神经元总数的10%¹²。在颗粒细胞层或锥体细胞层中偶尔记录到的中间神经元或胶质细胞，可通过其与主要神经元不同的电生理特性加以区分（参见《海马体专著》¹³）。

1. 吉欧密封（GΩ）的形成。在此过程中，玻璃移液管会以某种方式紧密附着于细胞膜上，在不同的膜片构型中（见下文第4和第5步），我们可以测量细胞膜上GABA激活通道的活性。
   将移液管插入移液管支架中，并拧紧固定移液管的帽盖。Axoclamp 200B放大器的设置为：电压钳模式（V-clamp），增益（Gain）为2，滤波器（Filter）为2 kHz，保持电位为0 mV，实验通过计算机使用PClamp软件进行。
2. 向连接至移液管支架的管道上的吹嘴吹气，并关闭吹嘴与管道之间的阀门。这会在移液管内产生正压。移液管内的正压具有两个作用：第一，移液管尖端会流出一股液体，当移液管进入浴液时，有助于保持尖端清洁；第二，通过膜片移液管对细胞膜施加轻柔的负压吸力，是形成高质量、高阻抗密封的关键步骤。通常只需打开控制移液管压力的阀门即可形成密封。因此，请确保系统无漏气。可通过将装有移液管的支架浸入盛水的烧杯中并向吹嘴吹气来检测是否存在泄漏。若观察到有气泡逸出，则说明该部分密封不严。
3. 将移液管缓慢浸入浴液中。在计算机屏幕上测量移液管电阻时，您会看到由5 mV脉冲序列产生的方波脉冲，以及显示移液管电阻值的数字。数值越小，表示移液管尖端开口越大，移液管越粗。将移液管偏压（offset）调整为0。
4. 与细胞膜形成密封。确定您要进行膜片钳制（即形成密封）的区域或细胞。在脑切片中，可在显微镜下使用10倍物镜识别海马体中的齿状回颗粒细胞层，或CA1和CA3区的锥体细胞层，这些区域在图像中呈现为明亮条带（见图1A）；也可使用60倍物镜识别单个表层锥体神经元。
   1. 调节移液管至视野清晰，使通过显微镜目镜观察时，能够同时看到目标区域/细胞和移液管。
   2. 使用粗调操纵器将移液管移至目标区域/细胞中央上方，并缓慢下移移液管，使其接近但尚未接触组织。
   3. 使用操纵器的微调装置，极其轻柔地将移液管下压至目标区域/细胞中央，同时密切观察计算机屏幕，实时监测移液管电阻的变化。继续缓慢下移移液管，直至观察到电阻值逐渐增大（数值升高）。
   4. 此时，通过打开阀门缓慢释放移液管内的正压，相当于施加轻柔的负压吸力，通常可自动形成吉欧级密封（高阻抗密封，GΩ）。若未形成，则向先前施加正压的吹嘴处轻轻吸气，即可形成Giga-Seal。
   5. 此时您已获得所谓的细胞附着式膜片钳构型（见图1B）。请调整快速和慢速电容补偿，以消除来自移液管及移液管支架的瞬态信号。在计算机屏幕上，您现在应看到一条平坦的电流轨迹。GΩ密封值越高，单通道记录中的信噪比就越好。

有时在海马脑片内部进行膜片钳记录可能具有优势。在某些情况下，细胞位于内部而非表面时状态更佳，因为内部环境提供了更好的保护。此外，当研究细胞外环境对细胞功能的影响时（例如细胞外GABA浓度对神经元紧张性电流产生的影响），在组织内部进行膜片钳记录可能更为有利。该膜片钳操作步骤与上述描述相同，唯一的区别是在将移液管尖端插入脑片之前，不应释放移液管内的正压。

5. 建立全细胞构型并记录全细胞电流：

1. 在细胞贴附式配置中，将电极内液电位调整至 -60 mV，或接近您所用细胞的静息膜电位。
2. 通过连接移液管支架的管道对移液管施加负压，同时观察计算机屏幕，注意电阻的变化以及进入细胞后出现的电容瞬变。当这种情况发生时，您就进入了所谓的 全细胞构型 或全细胞模式（图1B）。
   细胞膜电阻因细胞类型不同而异，取决于膜上通道的电导及其开放数量。细胞膜电容随细胞大小而变化。施加负压时应先轻柔操作，若难以进入细胞，可逐渐增加力度。也可采用脉冲式负压。
3. 有时需要对移液管与细胞之间产生的电阻进行补偿。这种补偿称为串联电阻或接入电阻（Rs 或 Ra）补偿，可通过软件或放大器上的控制旋钮手动完成。在我们的实验中，我们不对 Ra 进行补偿，但如果其值相对于初始接入电阻的变化超过 25%，则舍弃该实验。
4. 全细胞模式下记录的GABA激活的紧张性电流

在海马CA1锥体神经元的全细胞记录构型中，我们将钳制电位设定为-60 mV，并等待5至10分钟，以使电极内液与细胞内环境达到平衡。在此期间，记录信号逐渐稳定。实验过程中，我们持续监测串联电阻的数值。

实验在电压钳制条件下进行，通过全细胞膜测量通道群体中的电流。可根据电流的时相性和紧张性特征，区分GABA激活的突触性和细胞外电流。拮抗剂SR95531可抑制所有GABA_A电流。钳制电流的减小表明神经元中GABA激活的紧张性电流水平。

由于我们关注的是依赖于脑片中细胞外环境GABA的紧张性GABA激活电流，因此我们通常不记录位于脑片表面的细胞，而是记录脑片内部的细胞。用于调节GABA_A通道的激动剂和拮抗剂通过灌流液施加，能够到达脑片内部的细胞。实验过程中，灌流液在记录 chamber 中的流速为 2 - 3 ml / min。

6. 记录单通道电流：

实验采用细胞贴附式、膜内面向外或膜外面向外的膜片钳构型（详见下文），记录单个通道分子的电流，即单通道电流。Axoclamp 200B 设置为电压钳模式，增益为 500，滤波频率为 2 或 5 kHz。使用 PClamp 软件控制移液管电位，数据采样率设置为不低于 100 μs，并记录电流信号。为了最大限度减少单通道记录中的噪声，浴液体积保持较低，仅需刚好覆盖脑片即可。

1. 细胞贴附构型中的GABA激活通道。当在膜上形成吉欧姆（GΩ）封接时，即进入细胞贴附模式，可记录被移液管尖端所包裹膜片中的通道活动（见图1B）。由于GABA不能穿过细胞膜，因此将GABA加入移液管溶液中以激活膜片中的通道。突触外GABA激活通道的激活潜伏期可达数分钟。膜片电位 = - 移液管电位，即在PClamp中将电位设置为-40 mV时，膜记录到的是去极化40 mV的状态。
   细胞贴附模式记录的优点在于通道处于其天然环境中，并与正常的胞内蛋白和因子保持连接。缺点是无法确切知道记录时的实际电位，因为细胞的绝对静息膜电位未知，而膜片上的电位由移液管电位和细胞静息膜电位共同决定。
2. 内面向外构型中的GABA激活通道。在细胞贴附模式下，使用显微操作器的微调装置轻轻提起移液管，并将其从脑片侧向缓慢移开。此时即获得内面向外膜片，可进行内面向外模式记录。
   记录来自被移液管尖端所包裹的膜片（见图1B）。与细胞贴附模式相同，将GABA加入移液管溶液中以激活通道。但对于能够穿过脂双层的药物（如苯二氮䓬类、巴比妥类、丙泊酚等），则可将其加入灌流液中，因为这些药物可扩散进入移液管并调节通道功能[14]。膜片电位 = - 移液管电位，由于不存在如细胞贴附模式中叠加的静息膜电位，膜片电位等于 -移液管电位，例如在PClamp中将钳制电位设为-40 mV时，膜片电位即为精确的40 mV。
   内面向外构型的优点是可以将药物或酶直接施加于膜的内表面，从而检测其对通道特性的影响。与形成外面向外膜片相比，制备内面向外膜片时对通道所在膜环境的作用力较小，因此该撕离式膜片构型可能对通道复合物更为温和（详见下文）。
3. 外面向外构型中的GABA激活通道。在全细胞模式下，使用显微操作器的微调装置轻轻提起或回撤移液管。同时观察计算机屏幕上显示的膜片特性窗口。当将移液管从细胞上逐渐拉开时，电容瞬变信号会消失，并再次形成GΩ封接。此时已形成外面向外膜片，可进行外面向外模式记录。
   细胞膜在移液管尖端开口处重新封合，膜的内侧朝向移液管内部，而原本的膜外侧则面向记录浴槽（图1B）。此时，GABA及其他待测药物需溶解于灌流液中。膜片电位 = 移液管电位，与全细胞模式相同，例如在PClamp中将钳制电位设为40 mV时，膜片电位即为精确的40 mV。
   外面向外模式的优点在于可精确控制膜电位，且由于膜的原始外侧面向实验浴槽，待用药物可直接溶解于灌流液中，便于快速施加和洗脱。缺点是通道可能已失去与其相连的胞内甚至跨膜蛋白及功能因子，因为在膜重新封合过程中部分分子可能丢失，或局部膜环境发生改变。然而，综合运用不同的膜片构型，可在分子水平上解析通道特性，这是目前其他任何方法都无法实现的。

7. 分析结果：

使用 PClamp 软件分析单通道和全细胞电流。对于突触事件的分析，我们使用 Synaptosoft（GA，美国）或 AXOGraph（悉尼，澳大利亚）。

8. 代表性结果：

图2A显示了在齿状回颗粒神经元的细胞贴附式膜片中，由20 nM GABA浓度激活的单通道电流。通道达到最大电导的激活潜伏期为2分38秒，最大电导为44 pS¹⁵。膜片去极化40 mV。图2B展示了来自大鼠海马神经元的全细胞电压钳电流记录实例，用以识别紧张性电流和时相性电流。GABAA受体拮抗剂SR95531可抑制突触外（紧张性）和突触内产生（时相性）的GABA激活电流。我们将GABAA受体拮抗剂SR95531（100 μM）施加于（Ba）齿状回神经元和（Bb）胰岛素处理的CA1锥体神经元，结果显示SR95531阻断突触外通道引起基础电流基线偏移，从而揭示紧张性电流（Ba,b），而当SR95531阻断突触通道时，突触电流消失（Bb）。在基础条件下，CA1锥体神经元不表现出GABA激活的紧张性电流⁶，但当神经元暴露于生理浓度的胰岛素时⁴，GABA激活的紧张性电流得以形成。

图1A. 大鼠海马脑切片，标示的区域为CA1和CA3锥体细胞层以及齿状回（DG）颗粒细胞层。B. 膜片钳记录模式示意图。

图2A。 齿状回颗粒细胞上记录的细胞贴附式膜片中，由20 nM GABA激活的单通道电流（大鼠海马脑片）。钳制电位去极化40 mV（移液管电位 = -40 mV）。星号（*，1^st 当前迹线）可识别出在较快速时间尺度上（2^nd 当前记录（current trace）的来源。 B. 大鼠海马脑片中记录的全细胞电流 a. 齿状回颗粒细胞和 b. 在-60 mV钳制电位下对CA1区锥体神经元进行电压钳记录。CA1区实验中，脑片在室温下用1 nM胰岛素孵育2小时后记录电流。

讨论

全细胞电流代表细胞中活性通道产生的电流集合。GABAA通道特有的药理学特性及氯离子通透性使其相关电流能够被识别。突触通道的瞬时激活特性与细胞外突触通道的紧张性激活特性，使得神经元中表达的这两类GABAA通道易于区分。然而，只有通过单通道记录，才能研究产生紧张性电流的通道分子的动力学特性。与在100 μs内即可激活的突触通道不同，紧张性GABAA通道在施加GABA后需数分钟的潜伏期才能激活^{4,7,15,16,17,18}。这种通道的延迟激活导致许多通道特性无法通过全细胞记录进行研究。在单通道水平上，可根据功能和药理学特性的差异，区分GABAA通道的不同亚群。因此，充分利用不同膜片钳构型所提供的优势，可深入研究介导神经元紧张性与突触电流的GABA激活通道的分子功能与药理学特性。

材料

本文使用的材料清单

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市面上有多种膜片钳硬件和软件系统，它们均基于相同的基本原理运行。在本实验室中，我们使用 Axoclamp 放大器和 PClamp 软件（Molecular Devices，USA）进行实验记录与数据分析。另一款广泛应用的品牌是 HEKA 放大器及软件（HEKA Elektronik，Germany）。 显微操作仪：Narishige MF-830（日本）；振动切片机：例如 Leica VT1200S（德国）或 Campden Instruments 振动切片机（英国）；显微镜：Nikon Eclipse E600FN；水浴箱；显微操作器：定制及 Narishige 显微操作器（日本）；拉制仪：DMZ-universal（德国）或 Narishige PC-10（日本）；电极玻璃管：GC150F-15（Harvard Apparatus，英国）