需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

通过Vero细胞培养法检测野外采集蚊虫中的感染性病毒

18K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/2889

⸱

2011年6月9日

 ,  ,  ,  , 
1Center for Vector Biology and Zoonotic Diseases, Department of Environmental Sciences, The Connecticut Agricultural Experiment Station

本文内容

摘要

我们介绍了一种通过Vero细胞培养法对野外采集的蚊虫进行多种病毒处理和筛查的方法。利用该技术，我们已从美国康涅狄格州采集的蚊虫中检测出分属4个分类学科别的9种不同病毒。

摘要

蚊子可传播多种不同的病毒，包括西尼罗病毒、登革病毒和基孔肯雅病毒等重要的人类病原体。这些病毒在地方性流行区域的活动强度有所增加，并已扩散至新的地区，因此需要有效的监测和控制计划来应对这些威胁。监测病毒活动的一种策略是，从地方性流行地区采集大量蚊子，并检测其是否感染病毒。本文描述了如何通过Vero细胞培养法处理、加工和筛查野外采集的蚊子以检测传染性病毒。蚊子按捕蚊器的位置和种类进行分类，并分组为每池不超过50只个体的样本池。将混合样本在缓冲盐溶液中使用混合研磨仪进行匀浆处理，取其水相接种于融合的Vero细胞系（Clone E6）中。接种后第3至7天持续观察细胞培养物是否出现细胞病变效应，任何在细胞培养中增殖的病毒均通过相应的诊断检测进行鉴定。通过采用该方法，我们已从美国康涅狄格州采集的蚊子中分离出9种不同的病毒，其中5种已知可引起人类疾病。这三种病毒（西尼罗病毒、波多西病毒和拉克罗斯病毒）自1999年以来代表了北美洲或新英格兰地区的新记录。能够检测到多种多样的病毒，对于监测蚊媒种群中已存在的以及新出现的病毒至关重要。

方案

1. 蚊虫分选与鉴定

  1. 以下操作均在经培训可处理活体蚊虫的人员于专用的生物安全二级（BSL-2）实验室内的开放实验台上进行。整个操作过程中需维持“冷链”条件。
  2. 将蚊虫采集袋置于 -20°C 冰箱中冷冻 5 分钟，以麻醉活体成蚊。随后将采集袋转移至装有干冰的保温容器中，盖上盖子，使蚊虫暴露于二氧化碳环境中 1–3 分钟，以确保完全麻痹。
  3. 轻敲采集袋，使麻醉后的蚊虫落入置于干冰上的预冷托盘中。使用精细镊子分离雌性蚊虫，并将其放入塑料分装杯中。盖上杯盖后，将分装杯置于湿冰上。
  4. 借助安装在电子制冷台上的立体解剖显微镜（10–60X 变倍），根据蚊虫外部形态特征，利用描述性分类学检索表将蚊虫鉴定至种。
  5. 将已鉴定的蚊虫按种类分别混合成每池不超过 50 只的样本，放入含有铜弹珠的 2 mL 带盖螺口管中。每管均贴上唯一标识编号。
  6. 完成所有蚊虫的鉴定后，将螺口管放入已标记的袋子中，并置于装有干冰的泡沫塑料冷藏箱内保存。
  7. 将蚊虫池样本储存于 -80°C 超低温冰箱中，直至进行病毒检测。

2. 从蚊子中分离病毒的生物安全考虑

  1. 以下操作须由经过生物安全三级（BSL-3）实验室操作培训的人员在生物安全三级实验室中进行1。实验室设施、设备、操作程序和实践均需接受机构、州和联邦相关部门的监管与检查。在实施以下实验方案前，应取得相应的培训和批准。
  2. 根据具体操作穿戴适当的个人防护装备（PPE），例如一次性防护服、手套、面罩和呼吸器。
  3. 操作开始前和结束后，使用70%乙醇对工作台面进行消毒。
  4. 细胞培养物及可能具有传染性的材料均在II级生物安全柜（BSC）内操作。
  5. 蚊虫样本池在置于生物安全柜内的混合研磨仪中进行匀浆处理。
  6. 蚊虫匀浆液在防气溶胶密闭的微量离心机中进行离心。若该步骤无法在生物安全柜内完成，操作人员在启动离心机及取出样本时应佩戴呼吸器。
  7. 在生物安全柜（BSC）内接触过样本的移液器和吸头应在10%次氯酸钠溶液中浸泡，随后进行高压灭菌。所有实验室废弃物在丢弃前均须经高压灭菌去污处理。

3. Vero 细胞的制备

  1. 从一个大号组织培养瓶（175 cm²）中倾倒出培养基2将汇合的Vero细胞（克隆E6）弃入含漂白剂的废液杯中。
  2. 用5 mL PBS洗涤Vero细胞，将PBS加入培养瓶中，轻轻旋转培养瓶，使液体覆盖细胞层及瓶壁，确保完全覆盖整个单层细胞。
  3. 将 PBS 倒入废液杯中。
  4. 加入2.5 mL胰蛋白酶-EDTA溶液，轻轻晃动培养器皿，使液体均匀覆盖整个单层细胞，确保完全覆盖。
  5. 将烧瓶置于37℃培养箱中孵育5分钟°C，5% CO2.
  6. 轻轻振荡并旋转锥形瓶，使细胞从底部表面脱落。细胞应能轻易滑落；若细胞不易滑落，可额外孵育1-5分钟。
  7. 加入5 mL最小必需培养基（MEM）和5%胎牛血清（FBS），使用血清移液管上下吹打10–20次，以分散细胞团块。
  8. 加入额外的15 mL MEM和5% FBS，终体积为22.5 mL，充分混匀。
  9. 将40个小型组织培养瓶（25 cm²）置于生物安全柜中2）直立放置于两个架子上（每个架子20个培养瓶）。
  10. 将装有培养瓶的架子放入生物安全柜中，取下培养瓶盖，并将瓶盖直接放置在对应培养瓶前方。
  11. 使用血清移液管向每个培养瓶中加入4 mL含5%胎牛血清的MEM培养基。
  12. 将0.5 mL悬浮细胞分装至每个培养瓶中（˜1:6 传代比例）更换培养瓶瓶盖。
  13. 向原代大号组织培养瓶中加入50 mL MEM和5% FBS，瓶中含剩余的细胞悬液（˜2.5 mL），然后将培养瓶放回培养箱。同一培养瓶最多可重复使用至5代，之后应更换新的培养瓶。
  14. 将小型组织培养瓶成叠地放置在托盘上。轻轻晃动托盘，确保培养基均匀覆盖瓶底。
  15. 将小培养瓶置于37℃培养箱中° C，5% CO2 过夜培养至80-90%汇合度。

4. 蚊虫样本池的制备

  1. 检测过程中保持蚊虫样本处于低温环境。处理蚊虫样本时，使用预冷的冷冻架和混合研磨仪夹具、冰上保存的试剂以及冷藏离心机。
  2. 将装有蚊虫的离心管放入预冷的冷冻架中，每管加入 1–1.5 mL PBS-G 缓冲液。
  3. 从冰箱中取出混合研磨仪夹具，将 24 支离心管放入每个夹具中，然后固定到混合研磨仪上。
  4. 以每秒 25 个循环的速度均质化样品 4 分钟。混合研磨仪以高速震荡离心管，每管内的金属弹珠可破坏蚊虫组织。
  5. 在 7,000 rpm 条件下离心 6 分钟。
  6. 将离心管放回冷冻架中，直至接种至 Vero 细胞。

5. 用蚊虫混合匀浆接种Vero细胞

  1. 使用倒置显微镜检查每组至少一个组织培养瓶，以确认细胞融合度和细胞状态良好；预期覆盖率约为80-90%。
  2. 将20个小组织培养瓶排放在架子上，并根据每个蚊虫样本池对应的编号进行标记。
  3. 松开瓶盖，将组织培养瓶中的大部分培养基倒入废液杯中，仅保留足够完全覆盖细胞单层的培养基。
  4. 从每份处理过的蚊虫样本池中取100μL上清液，分别加入对应的组织培养瓶中。
  5. 重新盖紧培养瓶盖。
  6. 将培养瓶平放在摇床上，于室温下以35-40 rpm振荡5分钟。
  7. 将20个组织培养瓶放回直立位置并置于架子上，然后放入生物安全柜中。
  8. 每次打开3个组织培养瓶盖，使用血清移液管向每个瓶中加入4 mL生长培养基；随后重新盖上瓶盖。
  9. 确保移液管尖端不接触培养瓶口或瓶口边缘。若发生接触，须及时更换新的移液管尖端。
  10. 将组织培养瓶置于37°C、5% CO2条件下培养。

6. 筛选 Vero 细胞以检测病毒增殖

  1. 接种后3至7天，对已接种的组织培养瓶进行观察，检查是否存在病毒感染的迹象，即细胞病变效应（CPE）。
  2. 通过倾斜培养瓶并观察积聚在瓶底的培养基，肉眼检查细胞培养物是否出现CPE和/或污染。当细胞在CPE过程中退化或因酵母、真菌或细菌污染而生长时，培养基会呈现浑浊状态。
  3. 在倒置显微镜下重新检查显示培养基浑浊的细胞培养物。病毒会导致细胞变形，并从培养瓶表面脱落。对于可见污染物（如酵母、其他细菌、真菌或大量蚊虫碎片）的细胞培养物，需将原始蚊虫样本通过0.22μm注射器滤器过滤后重新检测。
  4. 使用血清移液管，无菌操作将1–2 mL来自病毒阳性细胞培养物的培养基分装至已标记的冻存管中。
  5. 病毒培养物在鉴定前需保存于-80°C环境中，鉴定采用相应的诊断检测方法进行。

7. 试剂的准备

  1. MEM，5% FBS。将37.6 g粉末状MEM溶解于终体积为4 L的dd H2O中。将溶液分装至培养基瓶中，每瓶500 mL，并进行高压灭菌。待溶液冷却后，无菌条件下向每瓶中加入26 mL热灭活胎牛血清、5.2 mL L-谷氨酰胺、5.2 mL抗生素/抗真菌剂以及10.4 mL 7.5%碳酸氢钠。4°C保存。
  2. PBS-G。将16 g NaCl、0.4 g KCl、2.3 g Na2HPO4、0.4 g KH2PO4和4 mL 0.5%酚红溶解于1000 mL dd H2O中。必要时用2 N NaOH调节pH至7.1–7.4。在另一个烧杯中，将600 mL H2O加热至沸腾。从加热板上取下，加入10 g明胶并溶解。将溶解后的明胶溶液加入PBS溶液中，并用dd H2O定容至2 L。将溶液分装至瓶中，每瓶100 mL，并进行高压灭菌。待溶液冷却后，无菌条件下加入42.8 mL热灭活兔血清和1.4 mL抗生素/抗真菌剂。4°C保存。
  3. PBS细胞洗涤液。将50 mL 10倍浓度的Dulbecco's PBS加入400 mL dd H2O中。用2 N NaOH调节pH至7.1。用dd H2O定容至终体积500 mL。使用0.2 µm真空滤器过滤溶液。将溶液分装至8 mL螺口管中，每管5 mL。4°C保存。

8. 代表性结果

在1997年至2010年期间，通过对美国康涅狄格州持续开展的全州范围蚊媒监测，共分离出属于4个分类学科的9种不同病毒（表1）。其中5种病毒已知可引起人类疾病，最重要的病原体为西尼罗病毒和东部马脑炎病毒。新发现包括：1999年首次从北美采集的蚊子中分离出西尼罗病毒2，2000年首次在美国东北部分离出波托西病毒3，以及2005年首次在新英格兰地区分离出拉克罗斯病毒4。

病毒科分离株数量地点数量检出年份数量人类疾病参考文献
西尼罗病毒黄病毒科1,0029412中度至重度，发热，脑炎2,5
东部马脑炎病毒披膜病毒科2924110重度，脑炎6,7
高地J病毒披膜病毒科1783911未知6
詹姆斯敦峡谷病毒布尼亚病毒科3057414轻度至中度，发热，脑膜炎8
波托西病毒布尼亚病毒科259764未知3
凯奇谷病毒布尼亚病毒科114518轻度至重度，发热，两例记录病例中出现神经系统疾病 
特里维塔图斯病毒布尼亚病毒科832111未知 
拉克罗斯病毒布尼亚病毒科111中度至重度，脑炎4
弗兰德斯病毒弹状病毒科442未知 

表1. 通过Vero细胞培养实验在野外采集的蚊子中检测到的病毒。蚊子于1997年至2010年期间在康涅狄格州全州监测过程中采集。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

Vero 细胞培养检测法是一种有效的方法，可用于筛查野外采集的蚊子中多种病毒的存在。这与分子检测方法形成对比，后者仅针对一种或少数几种目标病毒。此外，我们发现 Vero 细胞培养检测法的敏感性至少与逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）相当，甚至更高7，并且能够获得病毒分离株，这些分离株被保存在我们的参考文库中，供未来研究使用。然而，在许多情况下，细胞培养系统可能并不适用。该方法需要在生物安全三级（BSL-3）实验室中进行病毒培养，涉及额外的成本和专业培训；不过，细胞培养所需的耗材相对便宜，可在一定程度上抵消这些成本。还值得注意的是，大多数但并非全部蚊媒病毒均能在 Vero 细胞培养中产生细胞病变效应（CPE）9,10。登革病毒就是一个显著的例外，应通过其他诊断试验进行筛查。理想情况下，应联合使用分子检测和细胞培养方法来检测病毒感染。目前，我们正在使用常规和定量 RT-PCR 检测方法4,11,12，有时结合测序技术，以鉴定在细胞培养中分离到的病毒，并重新确认蚊子混合样本中的病毒感染情况。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

致谢

我们衷心感谢 John Anderson 博士、Andrew Main 博士和 Shirley Tirrell 博士对本研究的重要贡献。本工作部分得到了美国疾病控制与预防中心（U50/CCU116806-01-1）和美国农业部（58-6615-1-218、CONH00768 和 CONH00773）资助项目的支持。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
胎牛血清GIBCO，隶属于 Life Technologies16140
抗抗生素/抗真菌剂GIBCO，隶属于 Life Technologies15240
碳酸氢钠 NaHCO₃3，7.5% 溶液GIBCO，隶属于 Life Technologies25080
L-谷氨酰胺 200 mM 100倍GIBCO，隶属于 Life Technologies25030
粉末状最低必需培养基（MEM）GIBCO，隶属于 Life Technologies11700
10倍浓度 Dulbecco’s PBSGIBCO，隶属于 Life Technologies14080
胰蛋白酶-EDTAGIBCO，隶属于 Life Technologies15400
兔血清GIBCO，隶属于 Life Technologies16120
Vero细胞（克隆E6）ATCCCRL-1586
小型组织培养瓶，带透气盖，25 cm²2Falcon BD353112
大尺寸组织培养瓶，带透气盖，175 cm²2Falcon BD353108
铜镀层BB弹’秒，4.5 毫米Crosman0767
混合研磨仪RetschMM300
Isopack 冷冻架Eppendorf022510240

参考文献

  1. Chosewood, L. C., Wilson, D. E. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , 5 edn, U.S. Government Printing Office. (2007).
  2. Anderson, J. F. Isolation of West Nile virus from mosquitoes, crows, and a Cooper's hawk in Connecticut. Science. 286, 2331-2333 (1999).
  3. Armstrong, P. M., Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Main, A. J. Isolations of Potosi virus from mosquitoes (Diptera: Culicidae) collected in Connecticut. J Med Entomol. 42, 875-881 (2005).
  4. Armstrong, P. M., Andreadis, T. G. A new genetic variant of La Crosse virus (Bunyaviridae) isolated from New England. Am J Trop Med Hyg. 75, 491-496 (2006).
  5. Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Vossbrinck, C. R., Main, A. J. Epidemiology of West Nile virus in Connecticut, USA: a five year analysis of mosquito data 1999-2003. Vector Borne Zoonotic Dis. 4, 360-378 (2004).
  6. Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Tirrell-Peck, S. J. Multiple isolations of eastern equine encephalitis and highlands J viruses from mosquitoes (Diptera: Culicidae) during a 1996 epizootic in southeastern Connecticut. J Med Entomol. 35, 296-302 (1998).
  7. Armstrong, P. M., Andreadis, T. G. Eastern equine encephalitis virus in mosquitoes and their role as bridge vectors. Emerg Infect Dis. 16, 1869-1874 (2010).
  8. Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Armstrong, P. M., Main, A. J. Isolations of Jamestown Canyon virus (Bunyaviridae: Orthobunyavirus) from field-collected mosquitoes (Diptera: Culicidae) in Connecticut, USA: a ten-year analysis, 1997-2006. Vector Borne Zoonotic Dis. 8, 175-188 (2008).
  9. Lennette, E. H., Lennette, D. A., Lennette, E. T. Chapter 11. Diagnostic Procedures for Viral, Rickettsial, and Chlamydial Infections. , American Public Health Association. 189-212 (1995).
  10. Karabatsos, N. International Catalogue of Arboviruses Including Certain Other Viruses of Vertebrates. , American Society of Tropical Medicine and Hygiene. (1985).
  11. Lanciotti, R. S. Rapid detection of west nile virus from human clinical specimens, field-collected mosquitoes, and avian samples by a TaqMan reverse transcriptase-PCR assay. J Clin Microbiol. 38, 4066-4071 (2000).
  12. Lambert, A. J., Martin, D. A., Lanciotti, R. S. Detection of North American eastern and western equine encephalitis viruses by nucleic acid amplification assays. J Clin Microbiol. 41, 379-385 (2003).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

MEM
通过Vero细胞培养法检测野外采集蚊虫中的感染性病毒
联系我们
向图书馆推荐

隐私

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。