我们介绍了一种通过Vero细胞培养法对野外采集的蚊虫进行多种病毒处理和筛查的方法。利用该技术，我们已从美国康涅狄格州采集的蚊虫中检测出分属4个分类学科别的9种不同病毒。
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本文内容
摘要
摘要
蚊子可传播多种不同的病毒，包括西尼罗病毒、登革病毒和基孔肯雅病毒等重要的人类病原体。这些病毒在地方性流行区域的活动强度有所增加，并已扩散至新的地区，因此需要有效的监测和控制计划来应对这些威胁。监测病毒活动的一种策略是，从地方性流行地区采集大量蚊子，并检测其是否感染病毒。本文描述了如何通过Vero细胞培养法处理、加工和筛查野外采集的蚊子以检测传染性病毒。蚊子按捕蚊器的位置和种类进行分类，并分组为每池不超过50只个体的样本池。将混合样本在缓冲盐溶液中使用混合研磨仪进行匀浆处理，取其水相接种于融合的Vero细胞系（Clone E6）中。接种后第3至7天持续观察细胞培养物是否出现细胞病变效应，任何在细胞培养中增殖的病毒均通过相应的诊断检测进行鉴定。通过采用该方法，我们已从美国康涅狄格州采集的蚊子中分离出9种不同的病毒，其中5种已知可引起人类疾病。这三种病毒（西尼罗病毒、波多西病毒和拉克罗斯病毒）自1999年以来代表了北美洲或新英格兰地区的新记录。能够检测到多种多样的病毒，对于监测蚊媒种群中已存在的以及新出现的病毒至关重要。
方案
1. 蚊虫分选与鉴定
- 以下操作均在经培训可处理活体蚊虫的人员于专用的生物安全二级（BSL-2）实验室内的开放实验台上进行。整个操作过程中需维持“冷链”条件。
- 将蚊虫采集袋置于 -20°C 冰箱中冷冻 5 分钟，以麻醉活体成蚊。随后将采集袋转移至装有干冰的保温容器中，盖上盖子，使蚊虫暴露于二氧化碳环境中 1–3 分钟，以确保完全麻痹。
- 轻敲采集袋，使麻醉后的蚊虫落入置于干冰上的预冷托盘中。使用精细镊子分离雌性蚊虫，并将其放入塑料分装杯中。盖上杯盖后，将分装杯置于湿冰上。
- 借助安装在电子制冷台上的立体解剖显微镜（10–60X 变倍），根据蚊虫外部形态特征，利用描述性分类学检索表将蚊虫鉴定至种。
- 将已鉴定的蚊虫按种类分别混合成每池不超过 50 只的样本，放入含有铜弹珠的 2 mL 带盖螺口管中。每管均贴上唯一标识编号。
- 完成所有蚊虫的鉴定后，将螺口管放入已标记的袋子中，并置于装有干冰的泡沫塑料冷藏箱内保存。
- 将蚊虫池样本储存于 -80°C 超低温冰箱中，直至进行病毒检测。
2. 从蚊子中分离病毒的生物安全考虑
- 以下操作须由经过生物安全三级（BSL-3）实验室操作培训的人员在生物安全三级实验室中进行1。实验室设施、设备、操作程序和实践均需接受机构、州和联邦相关部门的监管与检查。在实施....
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讨论
Vero 细胞培养检测法是一种有效的方法，可用于筛查野外采集的蚊子中多种病毒的存在。这与分子检测方法形成对比，后者仅针对一种或少数几种目标病毒。此外，我们发现 Vero 细胞培养检测法的敏感性至少与逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）相当，甚至更高7，并且能够获得病毒分离株，这些分离株被保存在我们的参考文库中，供未来研究使用。然而，在许多情况下，细胞培养系统可能并不适用。该方法需要在生物安全三级（BSL-3）实验室中进行病毒培养，涉及额外的成本和专业培训；不过，细胞培养所需的耗材相对便宜，可在一定程度上抵消这些成本。还值得注意的是，大多数但并非全部蚊媒病毒均能在 Vero 细胞培养中产生细胞病变效应（CPE）9,10。登革病毒就是一个显著的例外，应通过其他诊断试验进行筛查。理想情况下，应联合使用分子检测和细胞培养方法来检测病毒感染。目前，我们正在使用常规和定量 RT-PCR 检测方法4,11,12，有时结合测序技术，以鉴定在细胞培养中分离到的病毒，并重新确认蚊子混合样本中的病毒感染情况。
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致谢
我们衷心感谢 John Anderson 博士、Andrew Main 博士和 Shirley Tirrell 博士对本研究的重要贡献。本工作部分得到了美国疾病控制与预防中心（U50/CCU116806-01-1）和美国农业部（58-6615-1-218、CONH00768 和 CONH00773）资助项目的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 胎牛血清 | GIBCO，隶属于 Life Technologies | 16140 | |
| 抗抗生素/抗真菌剂 | GIBCO，隶属于 Life Technologies | 15240 | |
| 碳酸氢钠 NaHCO₃3，7.5% 溶液 | GIBCO，隶属于 Life Technologies | 25080 | |
| L-谷氨酰胺 200 mM 100倍 | GIBCO，隶属于 Life Technologies | 25030 | |
| 粉末状最低必需培养基（MEM） | GIBCO，隶属于 Life Technologies | 11700 | |
| 10倍浓度 Dulbecco’s PBS | GIBCO，隶属于 Life Technologies | 14080 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | GIBCO，隶属于 Life Technologies | 15400 | |
| 兔血清 | GIBCO，隶属于 Life Technologies | 16120 | |
| Vero细胞（克隆E6） | ATCC | CRL-1586 | |
| 小型组织培养瓶，带透气盖，25 cm²2 | Falcon BD | 353112 | |
| 大尺寸组织培养瓶，带透气盖，175 cm²2 | Falcon BD | 353108 | |
| 铜镀层BB弹’秒，4.5 毫米 | Crosman | 0767 | |
| 混合研磨仪 | Retsch | MM300 | |
| Isopack 冷冻架 | Eppendorf | 022510240 |
参考文献
- Chosewood, L. C., Wilson, D. E. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , 5 edn, U.S. Government Printing Office. (2007).
- Anderson, J. F. Isolation of West Nile virus from mosquitoes, crows, and a Cooper's hawk in Connecticut. Science. 286, 2331-2333 ....
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